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小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对肝癌细胞的作用及机制研究

作　者: 沈洁
导　师: 罗荣城
学　校: 南方医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 酪氨酸激酶抑制剂 ZD6474 肝癌 抗肿瘤 血管内皮细胞生长因子受体 表皮细胞生长因子受体
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究背景和目的肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC),高发于非洲东南部和亚洲,我国是肝癌高发区,与低发区相比,其发病年龄较轻且病情进展较快。肝癌死亡率居全国各种肿瘤的第2位,并且近10年来死亡率一直呈上升趋势。目前手术切除和肝脏移植是治疗肝癌较为有效的方法,但是大多数患者出现症状时才到医院就诊,已经是中晚期,肿块太大或弥散,无法完全切除,患者90%已经失去了根治手术的可能。传统的放疗和化疗对无法切除的原发性肝癌治疗效果不佳。其中门静脉癌栓的形成,肝内及远处的侵袭转移是肝癌治疗效果差,病情进展快的重要原因。因此,进一步对肝癌进行研究,并寻求肝癌新的治疗方法和药物显得非常重要。临床实验结果显示,多靶点联合阻断信号传导是肿瘤治疗和药物开发的发展方向。肝细胞癌是一种富含血管的肿瘤,肿瘤血管的生成与VEGF相关。血管内皮生长因子(VEGF)是目前所知道的最强直接作用于血管内皮细胞生长因子,在肿瘤血管生成过程中发挥关键作用,也是促进肿瘤转移的重要因素。癌组织中VEGF的高表达多预示患者预后较差。ZD6474 (ZactimaTM Vandetanib)是一种苯胺基喹唑林化合物,为强效的口服的VEGFR酪氨酸激酶小分子抑制剂,其化学名为(N-4-溴-2-氟苯基)-6甲氧基-7(1-甲基哌啶-4)甲氧基喹唑林-4-氨。由Astrazeneca制药公司研发,目前处于Ⅲ期临床试验阶段。该药物可同时作用EGF受体、VEGF受体和RET酪氨酸激酶。2006年2月,被FDA批准用于治疗滤泡型、髓质型、未分化型以及局部复发或转移的乳突型甲状腺癌。ZD6474可以通过阻断VEGF受体直接抑制肿瘤血管生成,或通过EGFR受体抑制肿瘤生长。因此,ZD6474有望通过选择性抑制VEGFR2和EGFR酪氨酸激酶双靶点抑制肿瘤生长。第一章小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对肝癌细胞增殖、周期与凋亡的影响一、材料和方法1. HepG2细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养,3-5天传一次代,选择对数生长期细胞作为实验用；2.采取上述分组,镜下观察细胞大小,形状等；3. Hoechst33342/PI检测ZD6474作用后HepG2细胞凋亡情况；4.采取上述分组,用MTT法检测药物对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制,根据OD值计算细胞生长抑制率；5.采取上述分组,收集细胞用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。二、实验分为对照组,单药组。1.MTT法检测药物对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制,单药组分别加入设0.1、1.0、3.0、6.0、10.0、20.0、50.0、100.0μmol/L8个浓度组ZD6474,对照组不加药；2.倒置显微镜、Hoechst33342/PI、流式细胞仪检测细胞周期、凋亡单药组分别加入3种不同浓度ZD6474 3μmol/ L、6μmol/ L、50μmol/ L,对照组不加药；三、统计方法用SPSS 13.0统计软件。三个组间抑制率差异分析采用重复测量方差分析；细胞周期、细胞凋亡率采用单向方差分析；多重比较均采用LSD法,交互效应分析采用factorial analysis。四、结果1.倒置显微镜下,对照组细胞贴壁状态良好,呈多边形细胞,体积较大,胞浆丰满,细胞边界清楚。实验组细胞均有不同程度的形态变化,细胞变圆,体积缩小,但细胞膜结构完整。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。药物浓度为3.0μmol/L,发生形态变化的细胞数量增多。高剂量组细胞异常更多见,细胞数明显减少；2. Hoechst/PI 33342双染的ZD6474组细胞出现明显的变化(染色质凝聚,核皱缩,高蓝荧光的凋亡细胞)及细胞坏死(高红荧光)。随着药物浓度增加,凋亡细胞增多。在高浓度组,甚至可见部分坏死细胞。ZD6474可诱导HepG2凋亡；3.经不同浓度ZD6474处理后,肝癌HepG2细胞的生长抑制率随着给药浓度的增加和作用时间的延长而提高,提示ZD6474对HepG2细胞有较明显的生长抑制作用,且这种作用有明显的时间依赖性和剂量依赖性。4.细胞周期检测显示,给药组细胞的G0／G1期细胞均较对照组有所增多,并具有显著性差异(P<0.05)；S期细胞则较对照组有所减少,并同样具有显著性差异(P<0.05)。5.ZD6474处理后HepG2细胞经流式细胞仪检测结果显示,ZD6474能够明显诱导HepG2细胞凋亡,并随给药剂量的增加,凋亡率增高。第二章小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对肝癌细胞BCL-2基因的表达一、方法1.实时荧光定量PCR法检测细胞内BCL-2基因的表达情况。2.实验分为对照组,单药组ZD6474(3μmol/L)。二、统计方法所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计处理。统计软件的t检验进行统计处理,取P<0.05为差异有统计学意义。三、结果与对照组相比,Bcl-2基因表达量有所下降,并于对照组具有显著性差异(P<0.05)。结论ZD6474对HepG2肝癌细胞有抑制增殖作用,呈时间和剂量依赖性。给药组细胞的G0／G1期细胞均较对照组有所增多,S期细胞则较对照组有所减少,能够明显诱导HepG2细胞凋亡,并随给药剂量的增加,凋亡率增高。Bcl-2凋亡基因表达下降,说明能通过抑制Bcl-2表达途径,促进肿瘤细胞凋亡。

全文目录


摘要  3-7
ABSTRACT  7-12
前言  12-18
第一章 小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对肝癌细胞增殖,周期与凋亡的影响  18-35
  1、材料与方法  18-25
  2、结果  25-31
  3、讨论  31-35
第二章 小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对肝癌细胞BCL-2基因的表达  35-44
  1、材料与方法  35-36
  2、方法  36-38
  3、统计分析  38
  4、结果  38-41
  5、讨论  41-44
参考文献  44-49
英文缩略词  49-50
英文缩略词  50-51
成果  51-52
致谢  52-55
统计学证明  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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