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核蛋白SET丝氨酸9位点模拟磷酸化对PP2A的抑制作用

作　者: 严通海
导　师: 王小川
学　校: 华中科技大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 阿尔茨海默病核蛋白SET PP2A tau蛋白磷酸化细胞凋亡
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:阿尔茨海默病(Alzheimers Disease,AD)是最常见的神经退行性疾病之一,神经原纤维缠结和老年斑是其主要的病理学特征性改变。核蛋白SET/I2PP2A是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP2A的内源性抑制剂,主要分布在细胞核中,在细胞质中分布很少;胞浆PP2A活性下调是阿尔茨海默病(AD)发病最为关键的原因也被认可,但SET自核转运至胞浆的具体过程及其对PP2A活性影响的具体机制尚不清楚。方法:通过基因定点突变SET Ser-9为丙氨酸(相关位点不能被磷酸化)模拟SET的非磷酸化状态(npSET),将Ser-9突变为谷氨酸(利用其PO4基团的负电荷效应而更易磷酸化)模拟SET的磷酸化状态(pSET),构建npSET和pSET两个质粒。在细胞水平用Lipofectamine2000在HEK293/tau细胞转染分别转染pcDNA3.1,wtSET,npSET和pSET四个质粒.在转染后24 h,48 h和72 h后,使用CCK-8检测细胞活力;使用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶试剂盒测定PP2A活性;分别用western blotting(WB)和免疫荧光技术检测来检测tau蛋白过度磷酸化的程度和分布情况;WB检测一些相关细胞凋亡因子的表达情况。结果:(1)HEK293/tau细胞在转染磷酸化SET 24 h后细胞活力明显降低,相比转染野生型SET在48 h后才出现细胞活力降低,非磷酸化的SET在转染24 h,48 h和72 h都不会导致细胞活力降低;(2)磷酸化SET相比野生型SET对PP2A活性有更明显抑制作用,抑制强度大约是野生型SET的1.25倍,p值为0.006,非磷酸化SET相比pcDNA3.1对PP2A没有任何抑制作用;(3)在转染48h后,磷酸化SET对tau蛋白一些位点磷酸化作用非常明显,包括:Ser199,Thr205,Ser214,Ser262,Ser396和Ser404,而非磷酸化SET却不能促使tau蛋白上述位点的磷酸化;(4)在转染48 h后,磷酸化SET能上调bax/bcl-2比率,增强p53活性却没有导致细胞凋亡的发生。(5)过表达野生型,非磷酸化和磷酸化SET显著上调GSK-3β活性。(6)非磷酸化和磷酸化SET可以修饰PP2Ac Tyr307位点,使其磷酸化增强。(7)野生型SET和磷酸化SET可以修饰PP2A Leu309位点,使其去甲基化。(8)过表达磷酸化SET可以上调AKT活性,拮抗由p53,bax诱导凋亡的发生。结论:(1)核蛋白SET磷酸化增强对PP2A的抑制作用。(2)Ser9的磷酸化修饰不影响SET对GSK-3β活性的上调。(2)SET Ser9磷酸化抵抗细胞凋亡的发生。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-11
材料与方法  11-21
结果  21-30
讨论  30-33
小结  33
创新点  33
待研究的问题  33-34
参考文献  34-37
综述  37-48
  参考文献  44-48
致谢  48-49
附录  49

核蛋白SET丝氨酸9位点模拟磷酸化对PP2A的抑制作用

内容摘要

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