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用RNA干扰的方法对甘蓝型油菜油酸相关基因的功能的研究

作　者: 陈菁菁
导　师: 官春云
学　校: 湖南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 甘蓝型油菜油酸 RNA干扰遗传转化
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

油菜是我国最重要的油料作物之一,菜籽油占年产食用油的40%。随着人们生活水平的提高,对菜籽油的品质要求提高。高油酸含量的菜籽油被认为是有利于人们身体健康的,且高油酸油在医疗,工业,日常生活等很多方面显示出具大优势,因此提高油菜籽中油酸含量是目前油菜品质育种的重要方向。本文主要是从进一步探索油酸相关基因功能为出发点,以基因工程技术为主要手段,根据RNA干扰原理,从本实验室构建的油菜油酸突变体差减文库中挑选2个基因片段(经RT-PCR分析发现其在高油酸材料和低油酸材料中具有不同的表达模式),构建RNA干扰载体,用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜湘油15。1.设计引物从甘蓝型油菜湘油15的叶片DNA中扩增两个目的片段B34和B55。两个片段都分别正向和反向插入带有NapinA启动子的pFGC5941.Na载体,构建出两个RNA干扰载体PFGC5941.Na-34和pFGC5941.Na-55。2.干扰载体转入农杆菌,选择油菜试管苗的带柄子叶为外植体,侵染农杆菌进行转化,用PPT对侵染后诱导出的不定芽进行抗性筛选,得到的筛选最适浓度是1.8‰,并得到9株抗PPT抗性苗。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章文献综述  11-22
  1.油菜高油酸研究进展  11-13
    1.1 高油酸的优点  11
    1.2 高油酸油菜的育种方法  11-13
      1.2.1 传统的育种方法  11-12
      1.2.2 诱变育种  12
        1.2.2.1 物理诱变  12
        1.2.2.2 化学诱变  12
        1.2.2.3 复合诱变  12
      1.2.3 基因工程途径  12-13
  2.油酸脱氢酶FAD2的研究进展  13-14
    2.1 FAD2和fad2基因家族  13-14
    2.2 FAD2活性调节  14
    2.3 前景展望  14
  3.RNA干扰研究进展  14-19
    3.1 RNAi现象及其系统组成  14-15
      3.1.1 RNAi现象的发现  14-15
      3.1.2 RNAi系统的组成  15
        3.1.2.1 dsRNA和siRNA  15
        3.1.2.2 Dicer酶  15
        3.1.2.3 RISC  15
        3.1.2.4 RdRP  15
    3.2 RNAi的作用机制及特征  15-17
      3.2.1 RNAi的作用机制  15-16
      3.2.2 RNAi的作用特点  16-17
    3.3 RNAi的应用  17-18
      3.3.1 RNAi在植物研究中的应用  17
        3.3.1.1 在植物抗病毒研究中的应用  17
        3.3.1.2 在作物品质改良中的应用  17
      3.3.2 RNAi在基因治疗领域中的应用  17-18
    3.4 RNA干扰的应用方法  18
      3.4.1 目的片段的选择和干扰载体的构建  18
      3.4.2 植物中RNAi载体的导入方法  18
    3.5 RNAi的优缺点  18
    3.6 前景展望  18-19
  4.油菜遗传转化研究进展  19-22
    4.1 农杆菌介导法  19-20
    4.2 种质系统介导法  20
    4.3 直接导入法  20-22
      4.3.1 化学导入法  20-21
      4.3.2 物理导入法  21-22
第二章目的基因片段的克隆与RNA干扰载体的构建  22-34
  1 材料与方法  22-31
    1.1 材料  22
      1.1.1 试验品种  22
      1.1.2 菌株、载体与质粒  22
    1.2 方法  22-31
      1.2.1 油菜叶片总DNA的提取  22-23
      1.2.2 目的基因片段的PCR扩增  23-24
      1.2.3 PCR产物回收  24-25
      1.2.4 PCR回收产物与T载体的连接  25
      1.2.5 T载体转入大肠杆菌DH5α  25-26
        1.2.5.1 大肠杆菌感受态的制备  25-26
        1.2.5.2 连接产物的转化  26
      1.2.6 质粒的提取  26-27
      1.2.7 RNA干扰载体的构建  27-30
        1.2.7.1 干扰片段反向插入pFGC5941.Na质粒  27-29
        1.2.7.2 扰片段正向插入带有反向干扰片段的pFGC5941.Na质粒  29-30
      1.2.8 工程菌转化  30-31
        1.2.8.1 热激法转化大肠杆菌  30
        1.2.8.2 冻熔法转化根癌农杆菌  30-31
  2 结果与分析  31-34
    2.1 目的片段PCR扩增检测结果  31
    2.2 菌落PCR检测结果  31-32
    2.3 干扰载体的验证结果  32
    2.4 质粒转入农杆菌菌落PCR检测  32-34
第三章甘蓝型油菜湘油15的遗传转化及转化子的筛选  34-42
  1 材料与方法  34-39
    1.1 材料  34-36
      1.1.1 供试品种  34
      1.1.2 菌株和载体  34
      1.1.3 培养基  34-36
        1.1.3.1 YEB培养基  35
        1.1.3.2 MS培养基  35-36
      1.1.4 PPT稀释液  36
    1.2 方法  36-39
      1.2.1 外植体的准备  36
        1.2.1.1 种子灭菌  36
        1.2.1.2 无菌苗的培养  36
        1.2.1.3 外植体的获取  36
        1.2.1.4 预培养  36
      1.2.2 根癌农杆菌工作液的准备  36-37
      1.2.3 农杆菌侵染外植体  37
      1.2.4 PPT浓度筛选  37
      1.2.5 诱导生根和移栽  37-38
      1.2.6 转化子的筛选  38-39
  2 结果与分析  39-42
    2.1 培养供筛选用试管苗  39-40
    2.2 PPT浓度梯度筛选  40-42
第四章讨论  42-44
  1 载体构建部分  42-43
    1.1 引物的设计  42
    1.2 干扰载体的验证  42-43
  2 甘蓝型油菜湘油15的转化再生体系  43-44
    2.1 外植体的选择  43
    2.2 PPT的筛选  43-44
参考文献  44-50
致谢  50-51
作者简介  51

用RNA干扰的方法对甘蓝型油菜油酸相关基因的功能的研究

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