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绵羊同种及绵羊—山羊异种核移植研究

作　者: 谭晓颖
导　师: 窦忠英
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 绵羊山羊核移植异种核移植微卫星DNA
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

在绵羊同种及绵羊-山羊异种克隆胚构建过程中,为了完善克隆胚构建及培养体系,就离子霉素和乙醇分别联合6-D的激活、不同的融合和化学激活前培养时间和不同阶段添加饲养层对克隆胚发育的影响三个方面进行了研究。对绵羊同种核移植所得流产胎儿进行了分子生物学检测,结果表明:1. 5mmol/L离子霉素联合6-D激活同种克隆胚胎和异种克隆胚胎5min,其卵裂率、桑椹胚和囊胚发育率虽均高于7%乙醇联合6-D激活胚胎5min(同种依次为79.67%Vs73.39%、44.79% Vs 35.08 %以及11.97% Vs 8.18%,异种依次为76.00% Vs 72.13%、36.84% Vs 35.60%以及9.77% Vs 6.82%),但差异不显著(P>0.05),同种克隆和异种克隆胚胎比较,差异不显著(P>0.05)。表明易得到的乙醇可以替代离子霉素。2.融合前平衡1h的同种和异种胚胎卵裂率,桑椹胚率均比不平衡直接融合明显高(同种76.88% ,76.70% Vs 64.49%,63.16%;52.85%,43.04% Vs33.33%,28.33%;异种为76.09%,77.53%Vs70.09%,63.33%;46.07%,44.93% Vs 30.67%,28.07%)(P<0.05),但平衡1h与直接融合囊胚发育率差异不显著。激活前平衡2h与否直接影响激活胚胎的完整率。融合后平衡2h再激活,可以获得明显高于直接激活的胚胎完整率(同种95.81%,97.27% Vs 74.64%,69.85%;异种97.50%,96.40% Vs 78.76%,67.16%)。总的看来,融合和激活前分别平衡1h,2h的同种及异种克隆胚胎均获得效果较好的胚胎激活完整率,分裂率,桑椹胚发育率和囊发育率(同种95.81%,76.88%,52.85%,9.76%;异种为:97.50%,76.09%,46.07%,10.11%)。但无论平衡与否,胚胎的融合率都没有显著差异。3.在克隆胚培养前72小时添加饲养层有助于提高卵裂率(同种差异显著,84.08% vs72.96% vs75.76%(P<0.05);异种差异不显著,76.86% vs 69.38% vs 67.11%(P>0.05)),同种克隆和异种克隆胚比较,异种克隆胚的卵裂率和囊胚率明显低于同种克隆胚胎。而在72h之后添加饲养层共培养,桑椹胚和囊胚发育率与未添加的差异均不显著(P>0.05)(桑椹胚率同种31.47% vs 40.0 % vs 51.48%;异种,37.84% vs 39.22% vs 51.48%,囊胚率同种,7.69% vs 10.67 % vs 14.79%;异种,3.60% vs 5.88% vs 7.32%)。结果表明对同种和异种克隆胚胎而言,在前72h进行共培养,有利于胚胎的发育,而72h之后不需要饲养层共培养即可,同种克隆和异种克隆胚胎比较,差异不显著(P>0.05)。4.筛选5对微卫星引物对体细胞克隆绵羊流产胎儿DNA进行PCR扩增,12%聚丙烯凝胶电泳,硝酸银染色克隆胎儿的微卫星DNA指纹与供体细胞完全相同,而不同于其受体母亲和对照绵羊。证明该流产羔羊基因来源于供体细胞,为体细胞克隆绵羊。用Sry基因特异性引物扩增发现流产胎儿和供核细胞一样均为雄性,进一步证实了该流产胎儿为体细胞克隆绵羊。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
实验研究  11-26
  第一章国内外体细胞核移植研究进展  11-26
    1.1 哺乳动物体细胞核移植研究进展  11-12
    1.2 羊体细胞核移植的研究  12-17
      1.2.1 胞质受体  13
      1.2.2 供核细胞  13-14
      1.2.3 去核与注核  14-15
      1.2.4 激活  15-16
      1.2.5 克隆胚的培养和移植  16-17
    1.3 异种体细胞核移植研究历程  17-18
    1.4 克隆胚激活与胚胎发育  18-20
      1.4.1 电激活和化学激活前平衡时间的影响  18-19
      1.4.2 化学激活方法  19-20
    1.5 胚胎培养体系与胚胎发育  20-22
      1.5.1 单一培养系统  20-21
      1.5.2 共培养系统  21-22
      1.5.3 贯序培养系统  22
    1.6 研究中存在的主要问题  22-24
      1.6.1 羊体细胞核移植存在的问题  22
      1.6.2 异种核移植现存问题  22-24
    1.7 应用前景以及研究方向  24-26
实验研究  26-48
  第二章绵羊同种及绵羊－山羊异种克隆胚构建和发育  26-40
    2.1 材料与方法  26-30
      2.1.1 试验动物  26
      2.1.2 材料试剂  26-27
      2.1.3 仪器设备  27
      2.1.4 卵母细胞的采集和体外培养  27-28
      2.1.5 供体细胞的准备  28
      2.1.6 卵母细胞的去核与核移植  28-29
      2.1.7 克隆胚的融合和激活及体外培养  29
      2.1.8 实验设计  29-30
      2.1.9 统计分析  30
    2.2 实验结果  30-36
      2.2.1 绵羊同种及绵羊-山羊异种体细胞克隆胚体外发育和胚胎移植  30-31
      2.2.2 乙醇和离子霉素分别联合6-D 激活对同种克隆及异种克隆胚胎发育的影响  31-33
      2.2.3 融合和激活前平衡时间对绵羊同种及绵羊-山羊异种克隆克隆胚发育的影响  33-34
      2.2.4 共培养对绵羊同种及绵羊-山羊异种克隆胚发育的影响  34-36
    2.3 讨论  36-39
      2.3.1 不同激活方式对绵羊同种和绵羊－山羊异种克隆胚发育的影响  36-38
      2.3.2 共培养对绵羊同种及绵羊-山羊异种克隆胚发育的影响  38-39
      2.3.3 异种克隆胚胎发育能力低于同种体细胞克隆  39
    2.4 小结  39-40
  第三章绵羊体细胞克隆流产胎儿的分子生物学检测  40-48
    3.1 材料与方法  40-45
      3.1.1 实验材料  40-41
      3.1.2 主要试剂  41
      3.1.3 主要仪器设备  41
      3.1.4 主要试剂配制  41-42
      3.1.5 实验方法  42-45
    3.2 结果  45-47
      3.2.1 微卫星DNA 检测  45-46
      3.2.2 Sry 基因的检测  46-47
    3.3 讨论  47
    3.4 小结  47-48
参考文献  48-54
英文缩略词表  54-55
致谢  55-56
作者简介  56

绵羊同种及绵羊—山羊异种核移植研究

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