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中国美利奴绵羊MHC Class Ⅰ区段429P24BAC克隆序列组成与结构分析

作　者: 李刚
导　师: 高剑峰
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 32P标记中国美利奴绵羊 MHC cDNA文库 DNA探针
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：研究绵羊MHC classⅠ区段基因组成旨在寻找并研究与重要经济性状紧密相关以及与绵羊对疾病的感抗性相关的基因。以美利奴绵羊BAC文库中含有MHC片段的429P24BAC克隆为材料通过酶切末端标记制备放射性探针,与已构建的cDNA文库进行原位杂交以筛选含有MHC classⅠ区段基因序列目的克隆,通过对目的克隆测序及生物信息学分析,研究429P24 BAC克隆中基因的组成与结构。方法：1.从中国美利奴绵羊BAC文库中挑取MHC ClassⅠ区段的429P24 BAC克隆,培养,送北京华大基因测序,将测得的序列用Genscan 1.0真核生物软件来进行基因预测,进而对预测的信息进行分析,将序列与NCBI上的数据库资源进行比对,获得相关的注释信息。2.对美利奴绵羊BAC文库429P24 BAC克隆进行测序,将其酶切后通过末端标记制备成具有放射性的探针,通过噬菌斑原位杂交筛选构建好的cDNA文库,放射自显影获得目的克隆,并对目的克隆测序及进行生物信息学分析,研究429P24 BAC克隆中基因的组成与结构。结果：1.测序结果表明该克隆长度为182KB,将测得的序列用Genscan 1.0真核生物软件进行基因预测,结果显示该克隆有13个基因,这13个基因长度都在1,000bp以上。再将序列与GENEBANK上的序列进行比对,获得注释信息显示其序列大多与牛的序列的同源性较高。2.以429P24 BAC克隆为探针,筛选出的7个阳性克隆,经初步分析,这7个基因中有1个与已知的绵羊MHC ClassⅠ区段基因有较高的同源性,2个基因与绵羊细胞色素氧化酶基因和热休克蛋白基因有较高的同源性,另外2个基因与牛的序列有较高的同源性,剩余的两个基因与人的染色体17和鼠的序列有一部分同源性,所得到的基因可能与绵羊的免疫与疾病有关。3.通过所得的基因序列与429P24 BAC克隆序列比对,结果表明所得的基因确实是中国美利奴绵羊MHC ClassⅠ区段的基因。结论：1.现在生物研究很大程度上已经脱离不了生物信息学,采用生物信息学的方法,可以为我们更好的进行研究,在遇到很复杂的实验问题,尤其在基因组序列组成与功能研究方面,生物信息学更是占有重要地位,实验结果也显示用生物信息学的方法可以更有效的,更快捷的得到表达基因,而且方法比较简单,技术比较成熟。2.噬菌斑原位杂交,在库与库的杂交中,这种杂交是比较可行的,尤其是在研究一些丰度比较低的表达基因,这种方法以其灵敏度高,操作也比较简单,周期短等优点,而受到许多研究者的青睐,从本课题研究结果来看,这个方法也是切实可行的。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-11
英文缩写词表  11-12
1 前言  12-23
  1.1 主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的概述  12-17
    1.1.1 人的MHC  12-13
    1.1.2 猪的MHC  13
    1.1.3 鸡的MHC  13
    1.1.4 小鼠的H2和大鼠的RT1  13-14
    1.1.5 牛的BoLA  14
    1.1.6 绵羊的OLA  14-17
  1.2 MHC(major histocompatibility complex)分子结构、分布及功能  17-19
    1.1.2 MHC的分子结构  17
    1.2.3 MHC分子抗原的分布  17-18
    1.2.3 MHC分子的功能  18-19
  1.3 MHC与疾病的关系  19-20
  1.4 绵羊MHC分子的国内外研究现状  20-21
  1.5 cDNA文库的筛选方法  21
  1.6 本研究的目的和意义  21-22
  1.7 技术路线  22-23
2、材料和方法  23-31
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 文库  23
    2.1.2 药品与仪器  23-24
    2.1.3 常用试剂  24-25
  2.2 方法  25-31
    2.2.1 绵羊MHC class Ⅰ区段429P24 BAC克隆的基因预测  25
    2.2.2 利用GeneQuest软件分析429P24 BAC克隆酶切位点并筛选限制性内切酶  25
    2.2.3 绵羊MHC class Ⅰ区段429P24 BAC克隆质粒的提取  25-26
    2.2.4 绵羊MHC class Ⅰ区段429P24 BAC克隆质粒的酶切  26-27
    2.2.5 绵羊MHC class Ⅰ区段429P24 BAC克隆探针的制备  27
    2.2.6 以429P24 BAC克隆为探针筛选cDNA文库  27-31
3、结果  31-43
  3.1 绵羊MHC class Ⅰ区段429P24 BAC克隆的基因预测  31-32
  3.2 利用Gene Quest软件分析429P24 BAC克隆酶切位点并筛选限制性内切 #21酶  32-33
  3.3 绵羊MHC class Ⅰ区段429P24 BAC克隆质粒的提取结果  33-34
  3.4 绵羊MHC class Ⅰ区段429P24 BAC克隆质粒的酶切  34
  3.5 以429P24 BAC克隆为探针筛选cDNA文库的结果  34-36
    3.5.1 第一轮筛选结果  34
    3.5.2 第二轮筛选结果  34-35
    3.5.3 噬菌体的获得与单克隆剪切结果  35-36
  3.6 阳性单克隆序列的测序与生物信息学分析结果  36-43
    3.6.1 阳性单克隆序列的测序与比对结果  36-41
    3.6.2 生物信息学分析结果  41-42
    3.6.3 基因组成  42-43
4 讨论  43-47
  4.1 基因序列的功能与结构初步分析  43
  4.2 分离表达序列的方法研究  43-44
  4.3 噬菌斑原位杂交分离表达序列  44-45
  4.4 核酸探针制备  45-47
5 结论  47-48
参考文献  48-53
作者简介  53-54
致谢  54-55
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表  55

中国美利奴绵羊MHC Class Ⅰ区段429P24BAC克隆序列组成与结构分析

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