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低氧条件下鸡胚肺动脉内皮细胞内皮素-1的分泌及其对中膜平滑肌细胞的影响

作　者: 韩燕燕
导　师: 刘思当
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 内皮细胞源性ET-1 肺动脉高压 细胞培养 内皮细胞和平滑肌细胞 细胞内[[Ca2+]i mRNA表达 细胞凋亡
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


内皮素-1(ET-1)是由内皮细胞释放的具有强血管收缩作用的多肽,对平滑肌细胞有促增殖的作用。体外研究低氧环境下鸡胚肺动脉内皮细胞ET-1的产生,及其对肺动脉平滑肌的作用,进而为肉仔鸡腹水症和人类肺动脉高压发病机制的研究提供理论依据。本研究拟采用组织贴块法体外分离培养鸡胚肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞,利用免疫荧光技术对这两种分离培养的细胞进行鉴定。利用自制的低氧小室对这两种细胞进行低氧处理,采用放免法于低氧6h、12h、24h三个时间点检测内皮细胞ET-1的释放量,分别收集培养24h后的常氧内皮细胞培养液(NCM)和低氧内皮细胞培养液(HCM),-20℃保存。提取细胞总RNA进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)观察低氧环境下内皮细胞ET-1 mRNA和平滑肌细胞ETAR mRNA的表达。将平滑肌细胞分为低氧组(H)、低氧+常氧内皮细胞培养液(H+NCM,NCM终浓度为体积分数50%)组、低氧+低氧内皮细胞培养液(H+HCM,HCM终浓度为体积分数50%)组、低氧+低氧内皮细胞培养液+BQ123(H+HCM+B)组,BQ123(终浓度5μmol/ L-1)是内皮素A受体拮抗剂。CCK-8检测平滑肌细胞的增殖,Fura-2/AM检测平滑肌细胞内钙离子浓度。实验结果如下:(1)采用组织贴块法培养鸡胚肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞,经免疫荧光技术鉴定原代培养的细胞是我们需要的内皮细胞和平滑肌细胞。(2)内皮细胞经低氧处理后分泌ET-1的量较常氧环境下显著增加,表明低氧可刺激内皮细胞对ET-1的分泌。(3)平滑肌细胞内钙离子浓度,H+NCM组显著高于H组,H+HCM组显著高于H+NCM组,表明内皮细胞常氧和低氧培养液都可促进平滑肌细胞内钙离子浓度升高,H+HCM组显著高于H+HCM+B组,BQ123可显著抑制内皮细胞培养液促平滑肌细胞内钙离子浓度升高的作用。(4)H+NCM组平滑肌细胞的增殖显著高于H组,H+HCM组显著高于H+NCM组,表明内皮细胞常氧和低氧培养液都可促进平滑肌细胞增殖,H+HCM组显著高于H+HCM+B组,BQ123可显著抑制内皮细胞培养液促平滑肌细胞增殖的作用。(5)内皮细胞ET-1 mRNA和平滑肌细胞ETAR mRNA在低氧条件下表达都显著升高,表明低氧可刺激两者mRNA的表达。采用组织贴块法成功培养出鸡胚肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞,为以后禽类疾病的研究提供了良好的细胞模型。综合实验结果推测出低氧引起肉仔鸡肺动脉高压的发生机制是低氧导致内皮细胞ET-1mRNA和平滑肌细胞ETAR mRNA表达量升高,内皮细胞ET-1mRNA表达升高引起ET-1分泌增加,在低氧环境下的结果就是导致平滑肌细胞内钙离子浓度的升高和平滑肌细胞的增殖。禽类内皮细胞源性ET-1参与血管壁的重构,进而参与禽类肺动脉高压的形成,即腹水症的发生。

全文目录


中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 引言  12-32
  1.1 内皮素  12-19
    1.1.1 ET国内外研究现状  12-14
    1.1.2 ET的结构  14
    1.1.3 ET 在体内的分布  14-15
    1.1.4 ET 在机体内的合成  15
    1.1.5 ET 的合成和释放的调节  15-16
    1.1.6 ET 的生物学效应  16-17
    1.1.7 ET 对机体的生理调节及反馈机制  17-18
    1.1.8 ET 的清除  18
    1.1.9 ET 与疾病  18-19
  1.2 ET 受体  19-21
    1.2.1 ET 受体的类型及结构  19-20
    1.2.2 ET 受体的分布  20
    1.2.3 ET 的受体后作用机制  20-21
  1.3 内皮素受体拮抗剂  21-26
    1.3.1 选择性内皮素 A 受体(ET_AR)拮抗剂  22
    1.3.2 内皮素 B 受体(ET_BR)抑制剂  22
    1.3.3 非选择性 ET_A/ET_B受体拮抗剂  22-23
    1.3.4 ETR拮抗剂的应用  23-26
  1.4 细胞内钙信号传导系统  26-28
    1.4.1 质膜上的钙转移系统  26-27
    1.4.2 钙信号的产生和终止  27
    1.4.3 胞内钙信号的作用机制  27-28
    1.4.4 钙信号转导系统与肺血管重建  28
  1.5 反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的原理及应用  28-29
  1.6 本课题的提出与研究意义  29-30
  1.7 主要研究内容与目标  30-31
    1.7.1 研究内容  30
    1.7.2 研究目标  30-31
  1.8 主要实验方法  31-32
实验一 鸡胚肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞的培养  32-40
  1 材料  33-34
  2 培养皿的处理  34
  3 培养方法  34-37
  4 实验结果  37-38
  5 讨论  38-40
实验二 低氧条件下鸡胚血管内皮细胞源性内皮素对下层平滑肌细胞的影响  40-53
  1 材料  42-43
  2 方法  43-47
  3 结果  47-51
  4 分析与讨论  51-52
  5 结论  52-53
参考文献  53-62
致谢  62-63
附图  63-64
作者简介  64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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