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普氏原羚肠道微生物多样性的研究

作　者: 蔡重阳
导　师: 刘学端；李迪强
学　校: 中南大学
专　业: 生物工程
关键词: T-RFLP 肠道微生物保存方法普氏原羚动物保护
分类号: Q958
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 22次
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内容摘要

动物胃肠道存在着大量的微生物群落,构成一个复杂的微生物区系。这个复杂的群落包含有3000-5000种菌,总数达1013～1014,而其包含的基因数目是人基因组的100倍。通过对粪便中肠道微生物的研究能获得大量的生物学信息,因此它是肠道微生物研究领域的重要材料。方便高效的保存方法是开展动物肠道微生物研究的重要前提。珍稀濒危动物的迁地保护和重引入是动物保护工作者和全社会共同关注的热点问题,但迄今为止难以找到一个合理的生理指标对两者进行健康评价。肠道微生物与哺乳动物的食物与能量代谢,及其健康有重要的关系,并且与宿主有很多相关性,而且,做为肠道微生物研究样品的新鲜粪便较动物本身来说,取样要方便得多。普氏原羚(Procapra przewalskii)是我国特有的珍稀动物。最新调查显示其数量仅存600余只,处于极濒危状态。1、本研究选用了4℃保存,-20℃保存,DETs缓冲液和100%乙醇保存等4种方法探讨不同保存方法对粪便中肠道微生物DNA的保存效果,用T-RFLP(末端限制性片段长度多态性)结合16S rDNA分析,对不同方法不同保存时间(24h,7天,30天,90天)的DNA保存效果进行评估。结果表明：(1)4℃保存方法在24小时内保存效果良好,7天的保在效果也尚可,平均92.1%的T-RFs(末端限制性片段)得到保存。不推荐长期保存使用。(2)-20℃对粪便中肠道微生物DNA保存效果最好,30天内平均98.9%的T-RFs仍然存在,90天后有一定量肠道微生物的DNA降解,平均有83.1%的T-RFs得到保存。(3) DETs buffer也能对粪便中肠道微生物DNA保存有效保存30天,平均95.6%T-RFs得到保存,可方便于地用于野外采样,但三个月后其效果低于-20℃保存,并且细菌群落结构发生变化,70.3%的T-RFs得到保存。(4)100%乙醇在一个星期内保存效果良好,一个月后微生物群落有一定变化,平均有86.6%的T-RFs得到保存,考虑到其便携性与方便或得,对野外采样较有价值。(5)优势T-RFs(相对峰面积>1%)相对于非优势T-RFs而言稳定性更高。2、通过T-RFLP和16S rDNA克隆文库构建,对青海省青海湖周边5个普世原羚分布区域野生种群和饲养种群的23个新鲜粪便样品肠道微生物多样性进行了研究,实验结论如下：(1)普氏原羚做为一个物种总体而言,其各个个体间的肠道细菌具有较高的相似性,不同区域间个体肠道细菌T-RFLP图谱相似性在50%-60%左右,相同区域内个体T-RFLP图谱的相似性一般在70%-80%左右。(2)不同区域的野生普氏原羚和圈养普氏原羚的肠道细菌有其各自的特点。同区域间个体T-RFLP图谱的相似性比区域外个体一般要高,各区域样品及圈养样品都有其特有的T-RFs,对于相对峰面积最大的T-RFs所代表的优势菌群而言,野生与圈养样品有很大的不同。(3)普氏原羚肠道中存在大量末培养细菌,做为一个极濒危物种,其肠道微生物基因资源值得进一步研究开发和保护。基于以上特点,我们认为肠道细菌群落有可能作为普氏原羚圈养与野外放生状态衔接的一个参考指标,并为普氏原羚的科学饲养提供参考。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-10
第一章绪论  10-26
  1.1 肠道微生物群落研究概况  10-13
  1.2 肠道微生物与宿主的关系  13-16
  1.3 分子生物学在肠道微生物群落领域的应用及研究进展  16-24
    1.3.1 16S rDNA基因克隆文库及宏基因组文库  17-19
    1.3.2 遗传指纹技术  19-22
    1.3.3 荧光原位杂交  22
    1.3.4 实时荧光定量PCR技术  22-23
    1.3.5 基因芯片技术  23-24
  1.4 问题与展望  24
  1.5 本研究的研究背景和意义  24-26
第二章不同保存方法对肠道微生物DNA的保存效果  26-39
  2.1 材料与方法  26-29
    2.1.1 样品采集及处理  26-27
    2.1.2 粪便总DNA提取  27
    2.1.3 16S rDNA的PCR扩增及回收  27-28
    2.1.4 T-RFLP  28-29
  2.2 结果与分析  29-36
    2.2.1 总DNA量  29
    2.2.2 T-RFLP图谱的丰度与均度  29-32
    2.2.3 不同处理及不同保存时间对T-RFLP的影响  32-36
  2.3 讨论  36-38
  2.4 本章小结  38-39
第三章野生及圈养普氏原羚的肠道微生物多样性  39-58
  3.1 实验材料  39-40
  3.2 实验方法  40-44
    3.2.1 总DNA提取  40
    3.2.2 16S rDNA基因扩增  40
    3.2.3 T-RFLP  40-42
    3.2.4 16S rDNA克隆文库及系统发育树构建  42-44
  3.3 结果分析  44-55
    3.3.1 总DNA及PCR产物  44-45
    3.3.2 普氏原羚肠道微生物T-RFLP图谱分析  45-51
    3.3.3 普氏原羚肠道细菌系统发育树  51-55
  3.4 讨论  55-57
  3.5 本章小结  57-58
第四章结论  58-59
参考文献  59-67
附录(appendix)  67-71
致谢  71-73
攻读学位期间主要研究成果  73

普氏原羚肠道微生物多样性的研究

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