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棉花线粒体atp9基因的克隆及其表达分析

作　者: 史计
导　师: 郭三堆；石庆华
学　校: 新疆农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉花线粒体 RFLP atp9基因 CMS 表达分析
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

棉花细胞质雄性不育(CMS)是母性遗传的性状,在生产中,通过不育系、保持系和恢复系的“三系”配套,充分利用杂种优势,利用“三系法”制种,可实现杂交棉种子规模化生产。在理论上,是研究花粉发育和核质互作的模式系统。陆地棉胞质不育系P30A(来源于104-7A的衍生系)为核心的三系配套已经大规模应用于生产实践中。大多数研究证实线粒体与细胞质雄性不育相关,多种植物中已经发现与胞质雄性不育相关的线粒体基因或ORFs。有关棉花的胞质雄性不育机理的研究相对较少。基于此现状,本文以P30A及其保持系P30B、恢复系Y18R为主要实验材料,以atp9基因的保守序列为探针进行了RFLP分析,同时利用Northern杂交和侧翼序列分析等技术,为进一步克隆不育基因奠定了基础。本研究主要研究结果如下：1.本研究通过同源克隆的方法,获得了棉花三系线粒体atp9基因的保守序列,以保守序列为探针对不育系P30A、保持系P30B、恢复系Y18R的线粒体基因组进行RFLP分析,发现在不育胞质和可育胞质存在EcoRⅠ限制性酶切多态性,通过EcoRⅠ和HindⅢ的限制性酶切的杂交结果确定atp9基因在线粒体基因组中为单个拷贝。2.通过Northern杂交具体分析了棉花三系幼蕾中atp9基因转录情况。结果表明atp9基因在三系中转录形式无明显差异,在三系中均存在两个转录本,均为一个强杂交带和一个弱杂交带。随后,我们通过cRT-PCR获取了各系的强杂交带序列全长。3.利用反向PCR (IPCR)方法,首次克隆到了可育胞质和不育胞质中atp9基因的所有HindⅢ(?)(?)制性酶切片段。在此基础上,应用Tail-PCR方法,获得了可育胞质和不育胞质中atp9基因的侧翼序列,大小分别为4369 bp和4361 bp。4.通过分析atp9基因的DNA序列和cDNA序列结果表明：三系中atp9基因编码区为225 bp,共编码74个氨基酸。存在7处C→U的RNA编辑位点,其中第75位由编码精氨酸的氨基酸转变为终止密码子使翻译提取终止。同时具体分析了棉花三系幼蕾中各编辑位点的编辑频率。结果显示：atp9基因在保持系中幼蕾的编辑频率要明显低于不育系和恢复系。本研究首次分析了棉花线粒体atp9基因转录本在三系中编辑情况,发现atp9基因的编辑与棉花胞质形式相关,而且不同的核背景也会影响编辑率,我们推测线粒体atp9基因与棉花的胞质雄性不育具有一定的相关性,但有待更进一步分析。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第1章绪论  8-18
  1.1 植物细胞质雄性不育  8-14
    1.1.1 高等植物线粒体基因组  8-9
    1.1.2 胞质不育相关的线粒体基因研究策略  9-10
    1.1.3 胞质雄性不育相关的线粒体嵌合基因(MCAGs)  10-12
    1.1.4 线粒体基因转录后加工与胞质雄性不育  12-13
    1.1.5 胞质雄性不育与核质互作  13-14
  1.2 棉花雄性胞质不育分子研究  14-15
  1.3 本研究内容、目的和意义  15-17
  1.4 技术路线  17-18
第2章 atp9基因在棉花中的RFLP分析及侧翼序列的获得  18-43
  2.1 材料与方法  18-32
    2.1.1 材料  18-19
    2.1.2 方法  19-32
  2.2 结果与分析  32-40
    2.2.1 棉花基因组的提取  32
    2.2.2 ap9基因的扩增  32-34
    2.2.3 RFLP结果分析  34-35
    2.2.4 可育胞质中atp9基因侧翼序列的克隆  35-36
    2.2.5 可育胞质中atp9基因的序列的生物信息学分析  36-39
    2.2.6 系统进化树的构建  39-40
  2.3 讨论  40-43
    2.3.1 棉花基因组提取  40-41
    2.3.2 atp9基因的RFLP分析  41
    2.3.3 TAIL-PCR和反向PCR  41-43
第3章棉花三系中atp9基因的转录研究  43-52
  3.1 材料与方法  43-47
    3.1.1 材料  43-44
    3.1.2 方法  44-47
  3.2 结果与分析  47-50
    3.2.1 棉花RNA提取  47-48
    3.2.2 atp9基因的Northern blot分析  48-49
    3.2.3 atp9基因的cRT-PCR分析  49-50
  3.3 讨论  50-52
    3.3.1 RNA提取  50
    3.3.2 Northern blot  50-52
第4章棉花三系中线粒体atp9基因的保守区域RNA编辑  52-59
  4.1 材料和方法  52-53
    4.1.1 材料  52
    4.1.2 方法  52-53
  4.2 结果与分析  53-57
    4.2.1 花蕾总RNA与反转录cDNA的检测  53-54
    4.2.2 atp9基因的RNA编辑  54-55
    4.2.3 atp9基因位点的编辑效率与胞质的关系  55-57
  4.3 讨论  57-59
    4.3.1 atp9基因的RNA编辑位点  57
    4.3.2 atp9基因的RNA编辑位点频率  57-59
第5章结论与展望  59-61
  5.1 结论  59
  5.2 展望  59-60
  5.3 创新点  60-61
参考文献  61-65
致谢  65-66
作者简历  66

棉花线粒体atp9基因的克隆及其表达分析

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