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苏云金芽孢杆菌cry基因型的鉴定

作　者: 胡晓婷
导　师: 冯书亮
学　校: 河北大学
专　业: 动物学
关键词: 苏云金芽孢杆菌分离鉴定 PCR-RFLP cry基因
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 71次
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内容摘要

为进一步发掘我国的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的菌株资源和新型的cry毒素基因资源,本研究从几种不同生境中采集土样分离出800株野生菌株,从中得出苏云金芽孢杆菌的分布具有一定的规律性：植被覆盖率越高,原始植被保存越完好的地区,Bt出菌率越高；土壤表面腐质层越厚,土壤所含腐殖质越丰富,Bt含量越多。800株野生菌株的伴孢晶体形态大多为圆形,还有方形、菱形,个别菌株同时含有2种或3种晶体,这说明我国菌株资源丰富,并具备多样性的特点。本研究利用PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)鉴定体系来鉴定Bt分离株的cry基因类型。根据基因保守区设计通用引物进行PCR扩增,扩增产物进行单酶切或双酶切,依其限制性片断长度多态性(RFLP)图谱分析其基因类型。其结果显示：含cry1类基因型的有107株；含cry2类基因型的有202株；含cry3类基因型的有15株；含cry-8类基因型的有361株；含cry7类的1株；含cry9类的57株；含cry40类的1.株；含cry6类的2株；含cry11类基因的有2株；没鉴定到基因类型的菌株58株,可能含有cry1-35,cry40以外的基因型或新的cry基因型。首次发现3株同时含有cry1类、cry2类、cry8类和cry9类的基因组合,它们的晶体形状都为菱形,都编码130kDa和90kDa的蛋白；这三株菌是否具有广泛的杀虫谱还有待今后进一步探究。菌株FSQ87的cry40基因得到1386bp长度的序列,经克隆、测序及序列比对,与模式基因cry40Ba保持88%的同源相似性；这一基因很可能是新的第三等级的模式基因,有待于该基因全长序列的测定。取含cry8类的Bt菌株,以铜绿丽金龟幼虫为试虫,进行杀虫活性测定,结果显示：校正死亡率为100%的菌株有13株。其中,有12株均含有编码毒杀铜绿丽金龟幼虫毒素蛋白的cry8Ca基因,这些菌株的伴孢晶体都含有分子量为130kDa的蛋白、晶体形态都为圆形,建议对这部分菌株继续克隆其全长基因,确定是否为第四等级的新基因,以便进一步进行多功能工程菌及转基因抗虫作物的研究和开发。而FTL53没有鉴定到已有的基因类型,有可能是新的cry基因型。取没有检测到cry基因型的Bt菌株,以小菜蛾为试虫,进行杀虫活性测定,结果表明校正死亡率为100%的菌株有3株,分别是：L12、yn5和HF4。这3株菌推测其可能含有cry1-35，cry40以外的基因型或者是新的编码杀灭小菜蛾毒素蛋白的基因。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
1 引言  10-23
  1.1 苏云金芽孢杆菌的生物学特性及分布  10-11
  1.2 苏云金芽孢杆菌的杀虫毒素  11-12
  1.3 苏云金芽孢杆菌的cry基因分类  12-13
  1.4 苏云金芽孢杆菌cry基因的定位  13-14
  1.5 苏云金芽孢杆菌的cry基因型的鉴定  14-16
  1.6 苏云金芽孢杆菌cry基因与生物活性的关系  16-20
  1.7 重要的地下害虫金龟子幼虫  20-21
  1.8 本研究的目的及意义  21-23
2 材料和方法  23-33
  2.1 材料和仪器  23-26
    2.1.1 菌株和质粒  23
    2.1.2 培养基  23-24
    2.1.3 引物  24
    2.1.4 试剂  24-25
    2.1.5 供试昆虫  25-26
    2.1.6 仪器设备  26
  2.2 研究方法  26-33
    2.2.1 菌株的分离  26
    2.2.2 菌株的保存  26-27
    2.2.3 菌株的整理与活化  27
    2.2.4 模板制备  27
    2.2.5 PCR反应  27-28
    2.2.6 酶切分析  28
    2.2.7 琼脂糖凝胶电泳  28
    2.2.8 SDS-PAGE分析  28-29
    2.2.9 E.coli质粒DNA提取  29-30
    2.2.10 DNA回收  30
    2.2.11 连接反应  30
    2.2.12 E.coli感受态细胞制备  30-31
    2.2.13 E.coli的转化  31
    2.2.14 序列测定及分析  31
    2.2.15 菌株杀虫活性测定  31-33
3 实验结果与分析  33-61
  3.1 菌株分离  33-34
  3.2 菌株的伴孢晶体形态的多样性  34
  3.3 苏云金芽孢杆菌cry基因的鉴定  34-49
    3.3.1 cry基因型的组合情况  35-43
    3.3.2 鉴定到的基因具体类型及数量  43-49
  3.4 苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的SDS-PAGE分析  49-51
  3.5 部分测序结果  51-54
  3.6 生测结果  54-61
4 讨论与结论  61-64
  4.1 讨论  61-62
  4.2 结论  62-64
参考文献  64-72
致谢  72-73
发表论文情况  73

苏云金芽孢杆菌cry基因型的鉴定

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