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黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞NO浓度和PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

作　者: 吴青
导　师: 徐寒松
学　校: 贵阳中医学院
专　业: 中西医结合临床
关键词: 黄芪多糖 内皮祖细胞 一氧化氮 磷脂酰肌醇-3激酶 蛋白激酶B 内皮型一氧化氮合酶 磷酸化
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：探讨黄芪多糖(Astragalus Polysaccharides, APS)对2型糖尿病患者(T2DM)外周血内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)一氧化氮(nitric oxide, NO)浓度和蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表达的影响,探讨APS对T2DM患者外周血EPCs的影响及其作用机制。方法：制备鼠尾胶原,选择T2DM患者和健康人对照组各20例,密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,置于鼠尾胶原预包被的培养瓶中培养,7d后收集贴壁细胞,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜鉴定EPCs。健康人EPCs仅作为对照组,不予药物干预；MTT实验检测APS对T2DM患者EPCs增殖的影响。观察不同浓度黄芪多糖(0,50,200,800,3200,6400mg/L)分别干预6、12、24、48h对T2DM患者EPCs的影响；然后加用PI3K抑制剂LY294002进行干预。用Griess重氮化反应法检测NO的浓度,Western blot检测磷酸化Akt (p-Akt-Ser473)及磷酸化eNOS(p-eNOS-Ser1177)的表达。结果：T2DM患者EPCs的增殖能力较健康对照组明显下降(P<0.05)。黄芪多糖(APS)显著增加T2DM患者EPCs的No浓度和增殖能力,呈一定的量效与时效关系,在200mg/l浓度时开始较T2DM对照组明显增强(P<0.01),于800mg/l浓度时达最大效应(P<0.01)。800mg/1APS作用6h后,T2DM患者EPCs增殖能力开始明显增强,24h达到高峰,48h时略有下降,但仍明显高于对照组。APS呈剂量依赖性地增强T2DM患者EPCs磷酸化Akt及磷酸化eNOS的表达(P<0.05)；PI3K抑制剂LY294002能阻断黄芪多糖增强的磷酸化Akt和磷酸化eNOS的表达(P<0.05)。结论：鼠尾胶原可代替EPCs培养中常用的纤维连接蛋白,是体外分离培养外周血EPCs的更节省的一种方法。黄芪多糖(APS)能通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路而升高EPCs NO的浓度,促进EPCs增殖。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-10
1 实验材料  10-13
  1.1 实验仪器  10
  1.2 材料和试剂  10-12
  1.3 细胞培养所用液体的配制  12-13
2 方法  13-22
  2.1 鼠尾胶原的制备  13
  2.2 标本采集  13
  2.3 内皮祖细胞的分离  13-14
  2.4 内皮祖细胞的培养  14
  2.5 内皮祖细胞的鉴定  14-15
    2.5.1 内皮祖细胞的表面抗原检测  14
    2.5.2 内皮祖细胞的染色鉴定  14-15
  2.6 MTT法检测黄芪多糖对内皮祖细胞增殖的影响  15
  2.7 黄芪多糖对T_2DM组EPC_s NO浓度的影响  15-16
    2.7.1 分组  15
    2.7.2 细胞上清液NO水平测定  15-16
  2.8 黄芪多糖对T_2DM组EPC_s p-AKT、p-eNOS蛋白表达影响  16-22
    2.8.1 分组  16-17
    2.8.2 Western blot主要试剂配制  17-19
    2.8.3 细胞总蛋白的提取  19-20
    2.8.4 检测总蛋白浓度  20
    2.8.5 蛋白质SDS-PAGE电泳  20-21
    2.8.6 转膜  21
    2.8.7 抗体孵育  21-22
    2.8.8 化学发光,显影,定影  22
    2.8.9 图像分析  22
3 统计学处理  22
4 结果  22-30
  4.1 临床资料  22-23
  4.2 内皮祖细胞的形态观察  23
  4.3 内皮祖细胞的鉴定  23-24
  4.4 黄芪多糖对内皮祖细胞增殖的影响  24-26
  4.5 黄芪多糖和PI3K阻断剂LY294002对内皮祖细胞分泌NO的影响  26-28
  4.6 黄芪多糖对内皮祖细胞p-AKT和p-eNOS蛋白表达的影响  28-30
5 讨论  30-33
6 结论  33-34
7 问题与展望  34-35
8 参考文献  35-38
附录一 缩略语表  38-40
附录二 综述  40-49
附录三 致谢  49-50
附录四 个人简介  50-51

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