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利用自组装技术在钛表面定向固定CD34抗体及其内皮化诱导研究

作　者: 陈诚
导　师: 陈俊英
学　校: 西南交通大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 钛层层自组装 CD34抗体内皮祖细胞内皮化
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 56次
引　用: 6次
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内容摘要

材料表面导致的凝血问题是与血液接触材料的关键科学问题。在人工心血管植入物表面形成类似天然血管内膜,即植入物的内皮化被认为是最终解决植入后血栓形成问题和提高远期通畅率的根本途径。本论文利用自组装技术在钛表面定向固定CD34抗体,以实现材料内皮生物化修饰,并对自组装生物修饰层进行表征和功能评价。钛经碱活化后,表面产生带负电荷的羟基,自组装一层带正电荷的亲和素,通过亲和素-生物素特异结合组装一层生物素化A蛋白,牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性位点,通过A蛋白结合CD34抗体的Fc端实现定向固定CD34抗体,并暴露出CD34抗体的Fab端。傅立叶红外漫反射(FTIR)和免疫荧光结果显示亲和素、生物素化A蛋白和CD34抗体成功组装到材料表面；接触角结果表明自组装生物修饰层材料表面的亲水性得到改善；扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)结果表明自组装生物修饰层材料表面较均匀平滑,组装后表面粗糙度Ra降低到55.84nm,这个尺度的粗糙度有利于内皮祖细胞(EPC)的粘附生长；石英晶体微天平(QCM)检测出封闭自组装过程定向固定CD34抗体量为192ng/cm2。内皮祖细胞体外静态实验结果表明,自组装生物修饰层钛表面有利于捕获内皮祖细胞,并对内皮祖细胞的粘附、生长与增殖有良好的促进作用。内皮祖细胞体外动态实验结果表明,在流动状态下,自组装生物修饰层钛表面捕获内皮祖细胞的能力明显优于活化钛,且有利于内皮祖细胞的生长和增殖。2H动物体内实验结果表明,定向固定CD34抗体材料表面能够捕获大量的内皮细胞(EC),只有少量血小板,并且血小板激活轻微,而活化钛表面内皮细胞很少,却附着较多血小板,并且激活较严重。15D动物体内实验结果表明,定向固定CD34抗体的材料表面形成一层平滑的细胞层,但是活化钛表面却形成以平滑肌增生为主的组织。HE染色结果显示,定向固定CD34抗体材料表面诱导的组织更接近天然的内膜组织,其Ⅷ因子鉴定结果为阳性,说明其表面诱导的细胞是内皮细胞,并具有血管内皮细胞的功能。机理研究表明,自组装生物修饰层钛表面有利于捕获循环血液中的内皮祖细胞。材料表面形成内皮祖细胞单层后,不粘附、不激活血小板,从而提高材料的血液相容性。总之,定向固定CD34抗体材料表面在体外静态和动态下都有利于EPC的粘附和生长,并且动物体内也获得了良好的内皮化效果,本文探索出了心血管植入材料表面改性的一种新途径。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章绪论  14-34
  1.1 生物医用材料  14-15
    1.1.1 生物医用材料的概念  14
    1.1.2 生物医用材料的分类  14-15
    1.1.3 生物医用材料的应用要求  15
  1.2 生物医用材料的表面改性  15-17
    1.2.1 物理化学改性  16
    1.2.2 表面形态改性  16-17
    1.2.3 生物化改性  17
  1.3 生物材料表面促内皮化改性研究  17-23
    1.3.1 内皮细胞概述  17-19
    1.3.2 生物材料促内皮化的研究现状和存在的问题  19-23
  1.4 层层静电自组装在生物材料表面促内皮化研究中的现状与分析  23-29
    1.4.1 自组装的起源  23-24
    1.4.2 聚电解质的层层静电自组装技术  24-25
    1.4.3 聚电解质静电自组装技术在生物材料表面生物化修饰中的应用  25-29
  1.5 本论文的研究目的和意义及研究内容  29-32
    1.5.1 研究目的与意义  29-32
    1.5.2 研究内容  32
  1.6 本论文的技术路线  32-34
第2章实验方法与原理  34-45
  2.1 构建诱导内皮化自组装层的方法  34
  2.2 诱导内皮生物化自组装层的表征及其原理  34-41
    2.2.1 自组装原理  34-35
    2.2.2 傅里叶变换红外图谱(FTIR)  35
    2.2.3 免疫荧光  35-37
    2.2.4 水接触角原理  37-38
    2.2.5 扫描电子显微镜(SEM)  38
    2.2.6 原子力显微镜(AFM)  38-39
    2.2.7 石英晶体微天平(QCM)  39-41
  2.3 表征与评价方法  41-44
    2.3.1 生物化自组装层的定性表征方法  41-42
    2.3.2 生物化自组装层的定量表征方法  42-43
    2.3.3 生物化自组装层的体外内皮祖细胞捕获能力评价方法  43-44
    2.3.4 生物化自组装层的体内评价方法  44
  2.4 本章小结  44-45
第3章钛表面诱导内皮生物化自组装层的构建与表征  45-63
  3.1 试剂和仪器  45-47
    3.1.1 实验试剂  45
    3.1.2 实验仪器  45-46
    3.1.3 试剂配制方法  46-47
  3.2 钛表面诱导内皮生物化组装层的构建  47-48
    3.2.1 钛的活化  47
    3.2.2 钛/亲和素/生物素化A蛋白/CD34抗体层的构建  47-48
  3.3 内皮生物化自组装层定性表征结果  48-53
    3.3.1 FTIR结果  48-49
    3.3.2 生物素化A蛋白免疫荧光结果  49-50
    3.3.3 接触角测量结果  50-51
    3.3.4 SEM结果  51-52
    3.3.5 AFM结果  52-53
  3.4 生物化自组装层的QCM定量表征结果  53-62
    3.4.1 QCM定量表征未封闭自组装过程结果  55-58
    3.4.2 QCM定量表征封闭自组装过程结果  58-60
    3.4.3 封闭与未封闭自组装过程对比与分析  60-62
  3.5 本章小结  62-63
第4章内皮祖细胞体外静态实验评价  63-76
  4.1 实验试剂及仪器  63-65
    4.1.1 实验试剂  63-64
    4.1.2 实验仪器及器皿  64
    4.1.3 试剂配制方法  64-65
  4.2 实验原理及内容  65-69
    4.2.1 实验原理  65
    4.2.2 实验前准备  65-66
    4.2.3 内皮祖细胞提取与培养  66
    4.2.4 内皮祖细胞的鉴定  66-67
    4.2.5 样品表面内皮祖细胞种植与免疫荧光染色  67-68
    4.2.6 Alamar Blue检测  68-69
  4.3 钛表面内皮化实验结果及分析  69-75
    4.3.1 内皮祖细胞的鉴定结果  69-71
    4.3.2 内皮祖细胞体外静态培养结果  71-74
    4.3.3 Alamar Blue定量检测结果  74-75
  4.4 本章小结  75-76
第5章内皮祖细胞体外动态实验评价  76-82
  5.1 实验仪器及试剂  76-77
    5.1.1 实验试剂  76
    5.1.2 实验仪器及器皿  76-77
    5.1.3 试剂配制方法  77
  5.2 实验原理及内容  77-80
    5.2.1 实验原理  77-78
    5.2.2 实验前准备  78
    5.2.3 流动槽装置介绍与灭菌  78-79
    5.2.4 样品表面内皮祖细胞种植与免疫荧光染色  79-80
  5.3 实验结果与分析  80-81
  5.4 本章小结  81-82
第6章动物体内实验结果  82-91
  6.1 实验仪器及试剂  82-83
    6.1.1 实验试剂  82
    6.1.2 实验器械及器皿  82
    6.1.3 试剂配制方法  82-83
  6.2 实验准备及内容  83-86
    6.2.1 实验前准备  83
    6.2.2 2小时动物实验  83-84
    6.2.3 15天动物实验  84-85
    6.2.4 动物实验样品检测  85-86
  6.3 动物体内实验结果  86-90
    6.3.1 2小时动物实验结果  86-87
    6.3.2 15天动物实验结果  87-90
  6.4 本章小结  90-91
第7章钛表面诱导内皮生物化自组装层对细胞相容性及内皮化对血液相容性影响的机理研究  91-99
  7.1 定向固定CD34抗体对细胞相容性的影响  91-96
    7.1.1 基底活化对细胞相容性的影响  91-93
    7.1.2 表面亲水性对细胞相容性的影响  93-94
    7.1.3 表面形貌对细胞相容性的影响  94-95
    7.1.4 亲和素/生物素与CD34抗体体系  95-96
  7.2 材料内皮化对血液相容性的影响  96-98
  7.3 本章小结  98-99
结论  99-101
致谢  101-102
参考文献  102-109
攻读硕士期间发表的论文及参与科研项目  109-110

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