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氢生理盐水对大鼠放射性肝损伤的保护作用及机制研究

作　者: 申荣喜
导　师: 杨甲梅
学　校: 第二军医大学
专　业: 外科学
关键词: 氢生理盐水放射性肝损伤氧化应激自由基凋亡线粒体损伤
分类号: R965
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的随着放疗新技术的发展，特别是三维适形放疗在肝癌和其他恶性肿瘤治疗中的应用，肝脏受到较大剂量辐射的概率升高，放射性肝损伤(Radiation-induced LiverDamage，RILD)发生率有所增加。放射性肝损伤发生后，肝功能往往会在短时间内迅速恶化，继而导致肝脏急性炎症损伤、纤维化、甚至是肝衰竭的发生，并通过机体循环影响其他组织和器官，使死亡率显著提高。放射性肝损伤的发生发展机制未得到充分，专家学者们至上世纪60年代起开展了广泛的研究，结果表明氧化应激反应在RILD的发生发展过程中扮演极其重要的角色，保持氧自由基的动态平衡，可以有效减轻肝损伤。自由基是体内“生化加工”过程中的重要产物。人体新陈代谢过程中，自由基不断产生和被清除，是生命运动所必需的物质。自由基在体内维持在一个动态平衡状态，任何打破这种平衡的因素都会引发氧化应激反应，导致各种炎性因子如TGF-β、IL-6的释放，从而引起细胞凋亡或坏死。羟自由基和亚硝酸阴离子是氧化应激损伤过程中最重要介质，体内尚未发现能有效清除的分子或物质。氢具有还原性，是自然界最简单的元素，能与氧化成分发生还原反应。各种因素常常会引起机体内的氧化应激和炎性反应发生。羟自由基和亚硝酸阴离子是氧化反应过程中氧化性能强的自由基，体内迄今尚未发现能有效清除它们的物质。大量研究表明，氢气能够对它们选择性地清除，而对具有信号传导功能的过氧化氢和一氧化氮无效，且基本无毒副作用。多种动物模型的研究证实，氢气可以保护多种器官的缺血再灌注损伤，如心梗再通后的缺血再灌注损伤。氢气通常的吸收途径是经呼吸道吸入，但是这种方式很不方便，并且存在安全隐患，很多专家与学者在改进这种局面上作了大量努力。我校潜水教研室成功地生理盐水将氢气通过一定的压力溶解于中，有效地解决了这一难题。研究证实，采用腹腔或静脉注射饱和氢生理盐水，可以改善并治疗对多种器官的缺氧再灌注损伤，如小肠移植后、脑梗后的缺血再灌注损伤[8]。基于氢生理盐水的选择抗氧化性，能特异结合并清除氧化能力强的羟自由基和亚硝酸阴离子等自由基，而对起信号传导作用的氧自由基无明显作用，结合放射性肝损伤的发病机制，本课题以放射性肝损伤大鼠模型，采用腹腔注射氢生理盐水的方法，拟验证氢生理盐水对大鼠放射性肝损伤的保护作用，并初步探讨产生保护的相关分子机制，为临床放射性肝损伤的预防和治疗提供一定的理论基础。研究内容和方法一、观察氢生理盐水对放射性肝损伤大鼠肝功能的保护作用1.检测氢生理盐水腹腔注射后大鼠肝脏组织中氢的浓度（氢微电极）2.通过r射线对肝脏局部照射建立放射性肝损伤大鼠模型，观察氢生理盐水对大鼠存活状况、体重的影响。3. r射线照射后采集血浆、肝脏组织，检测氢生理盐水对肝功能的影响（10天后，自动生化分析仪）。二、研究氢生理盐水减轻放射性肝损伤的可能机制1.观察放射性肝损伤后体内氧化应激水平及炎性状态的变化（1）检测氢生理盐水对肝脏病理形态及中性粒细胞聚集的影响（HE染色、IHC）。（2）检测放射前后肝组织中氧化反应的相关指标的变化，如MDA、SOD、CAT的含量（比色法）。（3）检测放射前后肝组织及血浆中炎性因子的表达差异，如TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1（ELISA法），同时检测肝组织MPO活性（比色法）及血浆内毒素指标（基质显色法），检测体内炎性反应水平。（4）检测肝组织中JNK、ERK1/2磷酸化程度（Western blot和免疫组化），观察氢生理盐水是否影响细胞内相关信号通路。2.观察氢生理盐水对肝细胞凋亡和线粒体损伤的影响（1）检测肝组织线粒体途径凋亡相关因子的表达情况，如Bax、Bcl-2（Western blot）；caspase-3、caspase-9（基质显色法+TUNEL法）。（2）分离出肝细胞线粒体（差速离心法），检测其中MDA、GSH、GSSH表达情况，评估线粒体发生氧化反应的水平（比色法）。（3）检测线粒体肿胀度、膜电位及ATP变化（荧光分光光度计）和线粒体呼吸功能（Clark氧电极法），观察线粒体损伤情况。（4）观察凋亡小体的形成及线粒体形态改变（透视电镜）结果一、氢生理盐水能明显减轻放射性肝损伤1.氢在大鼠肝脏内最高浓度约出现在氢生理盐水腹腔注射后5分钟，接着随时间延长而逐渐衰减，40分钟后浓度降至正常。2.氢生理盐水组血浆中TBIL、DBIL生理盐水对照组下降，ALT、AST含量较生理盐水对照组明显下降。二、氢生理盐水能有效抑制放射性肝损伤组织氧化应激水平及炎性反应1.有效抑制放射性肝损伤组织氧化应激水平氢生理盐水治疗组大鼠肝组织MDA表达较生理盐水对照组显著减少，同时，生理盐水对照组SOD、CAT表达明显较氢生理盐水治疗组减少。2.有效抑制放射性肝损伤组织氧化应激水平及炎性反应（1）HE、IHC显示氢生理盐水明显减少MPO活性和中性粒细胞浸润，对肝脏形态结构有明显保护作用。（2）治疗组大鼠肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1含量显著减少，同时血浆中HMGB1、内毒素含量也较对照组显著减少。（3）治疗组较生理盐水对照组肝组织中JNK和ERK1/2蛋白表达明显减少。三、氢生理盐水可通过保护线粒体和抑制肝细胞凋亡1、氢生理盐水能明显减轻放射所致肝细胞线粒体损伤和氧化反应（1）氢生理盐水治疗组较生理盐水对照组粒体中MDA、GSSH水平明显下降，而GSH含量显著升高。（2）氢生理盐水治疗组大鼠线粒体肿胀度较生理盐水对照组明显减轻，而线粒体膜电位明显升高，同时线粒体中ATP水平也有较大提高。（3）氢生理盐水治疗组较生理盐水对照组线粒体呼吸控制率和磷氧比显著升高。2、氢生理盐水能抑制线粒体途径凋亡（1）氢生理盐水治疗组较生理盐水对照组肝细胞凋亡显著减少。（2）氢生理盐水治疗组较生理盐水对照组Bcl-2水平显著升高。（3）氢生理盐水治疗组较生理盐水对照组cyto-c表达明显降低。（4）氢生理盐水治疗组较生理盐水对照组凋亡因子的表达显著减少。结论实验以放射性损伤大鼠模型为研究对象，验证氢生理盐水对放射性肝损伤的保护作用，并在细胞和亚细胞水平研究其相关分子机制，结论如下：一、腹腔注射氢生理盐水能显著增加大鼠肝组织内氢浓度二、氢生理盐水可以显著改善放射性肝损伤后肝功能三、氢生理盐水可以降低放射性肝损伤氧化应激水平及炎性反应四、氢生理盐水可以显著降低放射性肝损伤肝细胞线粒体损伤及氧化应激水平五、氢生理盐水能抑制放射性肝损伤肝细胞内线粒体途径凋亡，发挥抗凋亡作用六、氢生理盐水能有效减轻放射性肝损伤本课题发现氢生理盐水能保护放射性肝损伤，不仅从大体方面作了观察，还从细胞、亚细胞及分子水平作了深入研究，对氢发挥抗氧化作用及深层的机制做了初步的探索，相信能为氢的深入研究和应用提供一定的启发。

氢生理盐水对大鼠放射性肝损伤的保护作用及机制研究

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