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上调miR-21对HT-29细胞生物学行为及对5-FU和放疗敏感性影响

作　者: 邓军
导　师: 熊建萍
学　校:
专　业: 肿瘤学
关键词: 慢病毒载体 miR-21 HT-29细胞 耐药
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 22次
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内容摘要


目的：研究miR-21对大肠癌HT-29细胞生物学行为的影响，观察细胞对5-Fu及放射线敏感性的变化。方法：转染pre-miR-21慢病毒组为实验组，HT-29细胞组为空白对照组，转染无义序列NC慢病毒和U6慢病毒为阴性对照组。构建pre-miR-21慢病毒载体，荧光显微镜下评估转染情况，Taqman Real-time PCR检测转染前后miR-21表达变化，采用CCK-8法检测miR-21对细胞增殖能力影响，流式细胞仪检测细胞转染前后细胞周期分布情况及凋亡能力，细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，Transwell小室法观察细胞体外侵袭力。CCK-8法检测细胞对5-FU化疗敏感性变化，并计算各组半数抑制率（IC50），MMT法检测细胞对放疗敏感性。每项实验至少重复3次。结果：实时荧光定量PCR结果显示pre-miR-21慢病毒组miR-21表达升高4.228倍(p＜0.01)。与空白对照组和两组阴性对照组相比，上调miR-21表达明显促进HT-29细胞增殖（p＜0.01）；克隆形成能力显著增强（559±19vs375.67±21.01p＜0.01）；细胞凋亡减少（p＜0.05），早期凋亡（1.1±0.26vs6.67±0.81）%，晚期凋亡和死亡细胞（1.33±0.85vs5.53±1.1）%；细胞周期重新分布，G0/G1期向S期转换，G0/G1期细胞比例明显降低（36.53±0.92vs60.18±0.93）%（p＜0.01），S期细胞比例升高（56.8±1.02vs33.0±1.01）%（p＜0.01），G2/M期细胞比例无差异；细胞体外侵袭能力增强（穿膜细胞数104.8±6.72vs34.2±2.59，p＜0.01）；miR-21抵消部分5-FU化疗作用使化疗敏感性降低,上调组IC50（232.73±21.69μg/ml）是空白对照组（112.46±15.26μg/ml）的2.07倍(p＜0.01），细胞对X线放疗抑制率降低（16.76±1.87vs36.14±1.54）%（p＜0.05）。结论：慢病毒载体对HT-29细胞转染效率高。上调HT-29细胞miR-21表达能够抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞增殖能力、克隆形成能力及体外侵袭性，增加肿瘤细胞对5-FU及放射线的抵抗力。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
中英文缩略词表  8-9
第1章 引言  9-12
第2章 材料与方法  12-26
  2.1 实验材料  12-14
    2.1.1 细胞株  12
    2.1.2 细胞培养所需的的试剂以及材料  12
    2.1.3 完全细胞培养基的配置  12-13
    2.1.4 慢病毒转染相关试剂  13
    2.1.5 miRNA 的提取  13
    2.1.6 qPCR 相关  13
    2.1.7 CCK-8 细胞增殖试验  13
    2.1.8 Annexin V-PE/7-AAD 双染细胞凋亡检测和 PI 单染检测细胞周期分布  13-14
    2.1.9 细胞克隆形成  14
    2.1.10 细胞体外侵袭分析  14
    2.1.11 MTT 法检测化放疗敏感性  14
  2.2 主要仪器以及设备  14-15
  2.3 实验方法  15-25
    2.3.1 HT-29 细胞株的培养  15-16
    2.3.2 慢病毒载体构建  16-18
    2.3.3 慢病毒转染靶细胞  18
    2.3.4 荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光（GFP）强度  18
    2.3.5 筛选 GFP 稳定表达细胞  18-19
    2.3.6 实时定量 PCR 检测转染前后 miR-21 表达量的变化  19-21
    2.3.7 CCK-8 细胞增殖检测  21-22
    2.3.8 Annexin V-PE/7-AAD 双染标记细胞凋亡检测  22
    2.3.9 PI 单染细胞周期分析  22-23
    2.3.10 细胞克隆形成试验  23
    2.3.11 细胞体外侵袭分析  23-24
    2.3.12 CCK-8 法化疗敏感性检测  24
    2.3.13 MTT 法放疗敏感性检测  24-25
  2.4 统计学分析  25-26
第3章 结果  26-36
  3.1 HT-29 细胞生长状况  26
  3.2 转染后 GFP 绿色荧光表达强度  26-27
  3.3 实时定量 PCR 检测转染前后 miR-21 量的变化  27-28
  3.4 miR-21 对 HT-29 细胞增殖影响  28-29
  3.5 miR-21 对细胞周期的影响  29-30
  3.6 miR-21 对细胞凋亡影响  30-31
  3.7 miR-21 对细胞克隆形成的影响  31-32
  3.8 细胞体外侵袭分析  32-33
  3.9 miR-21 对细胞 5-FU 敏感性的影响  33-34
  3.10 miR-21 对 HT-29 细胞放疗敏感性的影响  34-36
第4章 讨论  36-43
第5章 结论及展望  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-49
综述  49-60
  参考文献  56-60

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 大肠肿瘤
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