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抗肿瘤转移和抗炎症小分子化合物的筛选及其机理研究

作　者: 韩红辉
导　师: 钱旻
学　校: 华东师范大学
专　业: 生物医学
关键词: 肿瘤转移肿瘤浸润胃癌 CADPE MMP-9 AP-1 炎症反应促炎症因子 NF-κB TNF-α IL-6
分类号: R735.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

恶性肿瘤是目前威胁人类健康和导致死亡的主要原因之一。据世界卫生组织统计,每年新增癌症患者1270万例,死亡约790万,且随着人们生活方式的改变和社会结构老龄化韵加剧,癌症的发病率将呈现持续增长的态势。胃癌是发生在胃粘膜上皮组织的恶性肿瘤,全球死亡率在各类肿瘤中位居第二。我国胃癌发病率高,致死率居各类恶性肿瘤之首,每年约有17万人死于胃癌,接近全部恶性肿瘤死亡人数的23.2%。随着胃癌的发生发展,癌细胞可扩散到胃的其他部位和机体其他组织器官,尤其是食道、肺、淋巴结和肝,这也是引起胃癌死亡的主要原因。癌发生和癌转移涉及一系列重要基因(如周期调节蛋白、凋亡相关基因、细胞间粘附因子以及uPA和MMPs等重要酶类)的表达和功能异常,因此修正相关基因的表达调控为肿瘤治疗提供了路径。和癌症一样,炎症相关疾病也是困扰人类多年的医学难题。通常炎症反应是机体对抗外来刺激时作出的防御性反应,以局部血管为中心,表现为红、肿、热、痛和功能障碍。正常情况下炎症反应能够清除外来物质,并使受损组织得以修复和愈合；但在一些病理情况下,例如有害刺激持续存在时,同样会攻击自身组织、导致疾病的发生。常见的炎症相关疾病有很多,如哮喘、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、肾小球肾炎、肠胃炎等,另外炎症过程中产生的炎症微环境对肿瘤的发生和转移也具有一定的促进作用。炎症过程中涉及众多细胞因子和炎症介质的分泌、释放,这些炎症因子对炎症过程具有极大的推进作用,理论上讲抑制这些炎症因子的分泌可有效调节炎症反应,从而达到抗炎的目的。该课题以本实验室合成小分子化合物为依托,通过筛选方法的建立,旨在获得一些潜在的抗肿瘤转移或抗炎症候选药物,并对它们具体的作用机理进行探讨。论文主要由两部分内容组成：一、抗肿瘤转移小分子化合物的筛选及其机理研究目前肿瘤细胞转移是引起患者死亡最主要的原因,约占癌症死亡人数的95%以上。肿瘤转移是一个复杂的、多阶段的过程,包括细胞增殖、细胞间粘连及细胞外基质的降解、向血管和淋巴管的浸润迁移、渗出血管或淋巴管、在其它部位形成新的病灶等。其中一个重要的环节就是肿瘤细胞获得浸润和迁移的能力,这个过程需要细胞外基质金属蛋白酶MMPs参与。MMPs可降解细胞外基质为癌细胞提供一个相对轻松的环境,从而有利于肿瘤细胞在组织中的游离和转移。根据肿瘤发生发展中的这些特征,我们开展了以下工作：(一)围绕肿瘤发生发展中的重要蛋白MMP-9,建立了以明胶酶谱分析、Transwell分析、启动子分析、WB、EMSA为主要手段的肿瘤转移抑制小分子化合物筛选体系,旨在获得一些潜在的具有肿瘤浸润转移抑制作用的候选药物,并对其可能的作用机理进行探讨。(二)通过筛选我们成功获得了小分子化合物CADPE,并对其肿瘤浸润迁移抑制活性,以及它具体的分子机制进行了深入研究,结果发现：1、CADPE在不影响胃癌细胞活力的情况下,可以较为明显的抑制胃癌细胞的迁移和浸润；这不仅表现在MGC-803细胞中,在另外两株胃癌细胞株AGS和HGC-27中也存在较明显的抑制作用。2、CADPE可显著抑制胃癌细胞及乳腺癌细胞中PMA诱导的MMP-9转录表达,而对其酶活及其内源性抑制剂TIMP影响不大。3、MMP-9特异性抑制剂可显著降低PMA诱导的胃癌细胞浸润,说明MMP-9和细胞浸润转移之间存在直接关联,而CADPE抑制MMP-9的表达很可能是抑制胃癌细胞浸润转移的主要机制之一。4、CADPE可抑制转录因子AP-1的转录活性。AP-1是调节MMP-9基因表达一个重要的转录因子,其相关信号通路PKC/MEK/ERK/AP-1被CADPE阻断后可抑制MMP-9基因的转录表达。综上所述,通过对小分子化合物筛选我们成功的获得了具有肿瘤转移抑制作用的小分子化合物CADPE,实验分析发现CADPE可显著抑制胃癌细胞的浸润迁移,同时降低明胶酶MMP-9的转录表达活性；其抑制肿瘤浸润的活性主要通过阻断FAK/MEK/ERK/AP-1信号通路以及MMP-9的表达来实现。这些结果提示,CADPE有可能作为一个潜在的、以MMP-9为靶点的抗肿瘤转移候选药物用于胃癌的治疗和进一步研究。二、抗炎症小分子药物的筛选及其机理研究在炎症过程中,局部血管、免疫系统以及损伤部位的细胞会做出一系列的应答促进炎症进程,其中涉及化学炎症介质的释放和炎性细胞因子的合成。在炎症介质组胺、白三烯、前列腺素、缓激肽、补体成分、血小板激活因子等的作用下,引起局部血管扩张、血管通透性增加、血液流速减缓以及白细胞在炎症部位的积聚、粘附和渗出。位于炎症部位的淋巴细胞和单核细胞会分泌大量促炎症因子,如TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8等,这些促炎症因子刺激其他细胞因子和炎症介质的分泌,并诱导单核细胞和巨噬细胞向炎症部位积聚。研究显示,TNF-α、IL-6、IL-1等过量表达会引起发热、组织损伤、休克、甚至死亡。针对炎症发生过程中的这些特点,我们进行了下列研究：(一)围绕炎症进程早期的促炎症因子TNF-a和IL-6,我们建立以Real-time PCR、 ELISA为主要手段的筛选体系,通过对小分子化合物的筛选,希望获得具有抗炎作用的候选药物,并对其可能的作用机理进行探讨。(二)通过筛选我们获得抗炎小分子化合物YF-449,并从分子、细胞和整体水平对其抗炎症反应机理进行了较为系统的分析,研究表明：1、YF-449在不影响小鼠巨噬细胞活力的情况下,能够较好的抑制促炎症细胞因子TNF-a和IL-6的分泌。2、YF-449可抑制炎症过程中一些重要酶类的表达,如MMP-9、iNOS和COX-2等,进而降低作为第二信使的NO和炎症介质PGE2的分泌。3、YF-449通过调节转录因子NF-κB的活化来达到抑制炎症相关基因的表达。4、YF-449通过抑制TLR4信号通路中IKKa和AKT磷酸化达到抑制IKBα磷酸化降解的目的,非磷酸化状态的IKBa结合在NF-κB上可阻断其入核。5、YF-449对LPS诱导的急性休克动物模型有较好的保护作用,在LPS+D-gelN致敏的记性休克小鼠模型中,YF-449能有效保护实验动物免受由炎症因子介导的炎症损伤,进而大幅提高小鼠的存活率。以上实验结果表明,抗炎候选药物的YF-449可通过调节TLR4/MyD88/IκBα/NF-κB信号通路以及促炎症因子TNF-α、IL-6和炎症相关基因iNOS、COX-2、MMP-9的表达达到缓解炎症症状的目的。YF-449可降低急性休克小鼠模型血清中促炎症因子TNF-α和IL-6的含量,从而控制炎症进程,对小鼠起到较好的保护作用。这些研究结果为YF-449作为抗炎候选药物用于进一步的研究和开发提供了理论依据。

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-15
第一部分抗肿瘤转移小分子药物的筛选及其机理研究  15-69
  前言  15-19
  第一章抗肿瘤细胞迁移小分子化合物的筛选  19-31
    一、引言  19-20
    二、材料和方法  20-24
    三、实验结果和讨论  24-30
    本章小结  30-31
  第二章 CADPE抑制胃癌细胞浸润迁移的机理研究  31-69
    一、引言  31-32
    二、材料和方法  32-44
    三、实验结果  44-66
    本章小结  66-69
第二部分抗炎症小分子药物的筛选及其作用机理研究  69-101
  前言  69-75
  第三章抗炎症小分子化合物的筛选  75-84
    一、引言  75-76
    二、材料和方法  76-78
    三、实验结果  78-83
    本章小结  83-84
  第四章 YF-449抑制炎症因子分泌及其机理研究  84-101
    一、引言  84
    二、材料和方法  84-88
    三、实验结果和讨论  88-100
    本章小结  100-101
论文总结  101-103
综述  103-141
  综述一  103-122
  综述二  122-133
  参考文献  133-141
附录Ⅰ 缩略词表  141-142
附录Ⅱ 攻读博士期间获得的成果和参加的科研项目  142-144
致谢  144-145

抗肿瘤转移和抗炎症小分子化合物的筛选及其机理研究

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