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HMME介导的光动力疗法治疗骨与软组织肉瘤的疗效及机理研究

作　者: 曾辉
导　师: 蔡郑东
学　校:
专　业: 骨外科学
关键词: 光动力疗法 血卟啉单甲醚 骨与软组织肉瘤 凋亡 caspase依赖通路
分类号: R738.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：探讨血卟啉单甲醚介导光动力疗法（HMME-PDT）的抗肉瘤效应及其机理。方法：1、体外实验中，流式细胞术检测骨肉瘤细胞（LM8）和成肌细胞（C2C12）在不同孵育时间及不同浓度HMME作用下胞内光敏剂的摄取量；MTT法检测HMME的在LM8细胞中的最佳孵育时间及对多株肉瘤细胞存活率的影响，流式细胞术检测骨肉瘤细胞凋亡率，Hoechst33342染色法观察细胞凋亡；实时荧光定量PCR（QRT-PCT）检测caspase-3、Bcl-x、p53和RelAmRNA相对表达量；蛋白免疫印迹(Western blotting)检测肿瘤细胞中caspase-1、-3、-6、-9、PARP、Bcl-x、p53及RelA蛋白相对表达量；不可逆caspase通路抑制剂（Z-VAD-FMK）及坏死抑制剂（Nec-1）检测PDT介导的细胞死亡形式。体外实验中，建立小鼠骨肉瘤模型，测定瘤体体积及瘤重评估PDT的抗肿瘤效应；hematoxylin-eosin(HE)染色检测肿瘤组织形态学改变；免疫组化法（Immunohistochemistry, IHC）caspase-1、-3、-6、-9和PARP在肿瘤组织中的表达。结果：1、光敏剂HMME选择性的聚集于骨肉瘤细胞中，而正常细胞摄取较少，且在骨肉瘤细胞中的摄取呈现孵育时间及浓度依赖性。HMME在肉瘤细胞内的最佳孵育时间为4小时，HMME-PDT能显著杀伤骨与软组织肉瘤细胞，且杀伤效应随着HMME浓度及能量密度的增高而增强。HMME-PDT可显著诱导贴壁及悬浮培养骨肉瘤细胞发生凋亡。Hoechst33342染色观察到典型的凋亡改变（核固缩、细胞变圆等）。QRT-PCT及Western blotting结果显示：HMME-PDT可显著上调caspase-3mRNA和蛋白相对表达量，而HMME-PDT可明显下调Bcl-x、p53、RelA mRNA和蛋白相对表达量；凋亡是HMME-PDT介导的细胞死亡的主要形式，且与caspase依赖的凋亡通路密切相关。2、HMME-PDT组肿瘤体积及瘤重均较空白组相比显著减小；肿瘤区域出现广泛坏死；HMME-PDT组小鼠肿瘤组织caspase-1、-3、-6、-9、PARP蛋白表达量显著上调。结论：HMME选择性的聚集于骨与软组织肉瘤细胞中，而正常细胞摄取较少；HMME-PDT对肉瘤细胞有显著的杀伤效应，且随着HMME浓度及能量密度的增高而增强；HMME-PDT诱导肉瘤细胞发生凋亡是其重要的杀伤机制；HMME-PDT能有效的抑制肉瘤的生长，其抗肉瘤效应与caspase依赖的凋亡通路密切相关。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第1章 引言  11-14
第2章 材料与方法  14-28
  2.1 实验材料  14-18
    2.1.1 实验细胞株  14
    2.1.2 实验动物  14
    2.1.3 试剂及耗材  14-16
    2.1.4 主要仪器  16-17
    2.1.5 主要试剂及配置方法  17-18
  2.2 实验方法  18-27
    2.2.1 细胞传代培养  18
    2.2.2 细胞计数  18
    2.2.3 光敏剂 HMME 摄收实验  18-19
    2.2.4 MTT 法检测 HMME 在肉瘤细胞中最佳孵育时间  19
    2.2.5 MTT 法检测肉瘤细胞存活率  19
    2.2.6 荧光倒置显微镜下观察细胞形态  19-20
    2.2.7 ANNEXINV-FITC/PI 法检测骨肉瘤细胞凋亡  20
    2.2.8 HMME-PDT 对悬浮培养细胞的影响  20
    2.2.9 HOECHST33342 染色法观察细胞凋亡  20-21
    2.2.10 QRT-PCR 检测 HMME-PDT 诱导的相关凋亡基因表达情况  21-22
    2.2.11 蛋白提取及定量  22-23
    2.2.12 WESTERN BLOTTING 检测初筛 CASPASE-3、BCL-X、P53、RELA 蛋白相对表达  23-24
    2.2.13 WESTERN BLOTTING 检测 CASPASE-1、3、6、9 和 PARP 蛋白相对表达  24-25
    2.2.14 HMME-PDT 介导的细胞死亡  25
    2.2.15 动物模型制备  25
    2.2.16 观察 PDT 在动物模型中的抗肿瘤效应  25-27
  2.3 统计学方法  27-28
第3章 实验结果  28-41
  3.1 HMME 选择性聚集于骨肿瘤细胞  28-29
  3.2 HMME 在肉瘤细胞中的最佳孵育时间  29
  3.3 HMME-PDT 抑制骨肿瘤细胞存活率  29-30
  3.4 镜下细胞形态学变化  30-31
  3.5 HMME-PDT 诱导贴壁骨肉瘤细胞凋亡  31-32
  3.6 HMME-PDT 诱导悬浮培养骨肉瘤细胞凋亡  32-33
  3.7 HOECHST33342 染色法观察到骨肉瘤细胞凋亡  33
  3.8 QRT-PCR 检测各凋亡基因 MRNA 表达水平  33-35
  3.9 WESTERN BLOTTING 初筛检测 CASPASE-3、BCL-X 、P53、RELA 蛋白相对表达情况  35-36
  3.10 Z-VAD-FMK 及 NEC-1 检测 HMME-PDT 介导细胞死亡  36
  3.11 WESTERN BLOTTING 检测 CASPASE-1、3、6、9 和 PARP 蛋白相对表达情况  36-37
  3.12 HMME-PDT 对鼠骨肉瘤抑制实验  37-38
  3.13 HE 染色观察肿瘤组织形态学改变  38-39
  3.14 免疫组化检测小鼠肿瘤经 HMME-PDT 处理后 CASPASE-1、3、6、9 和PARP 表达  39-41
第4章 讨论  41-45
  4.1 光动力疗法在骨肿瘤基础研究中的进展  41
  4.2 HMME-PDT 对好发的骨与软组织肉瘤细胞的杀伤效应  41-42
  4.3 HMME-PDT 介导的肉瘤细胞死亡形式  42
  4.4 HMME-PDT 介导的肉瘤细胞凋亡机制  42-43
  4.5 HMME-PDT 对体内骨肉瘤抑制作用  43-45
第5章 结论及展望  45-46
  5.1 结论  45
  5.2 展望  45-46
致谢  46-47
参考文献  47-49
攻读学位期间的研究成果  49-50
综述  50-57
  参考文献  55-57

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 运动系肿瘤 > 软组织肿瘤
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