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应用酵母双杂交系统筛选与PITX2相互作用的蛋白

作　者: 陈静
导　师: 柯铁
学　校: 华中科技大学
专　业: 遗传学
关键词: 房颤 PITX2 酵母双杂交
分类号: R541.75
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 6次
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内容摘要

心房颤动（房颤, atrial fibrillation），是临床上最常见并且危害严重的心律失常，其62%高遗传率提示遗传因子在房颤发生中起关键作用，但大部分房颤致病或易感基因还未发现。2007年，应用全基因组关联分析（GWAS）在冰岛人群中首次发现位于4q25区域的SNP rs2200733与房颤高度关联，随后在不同的群体研究中得到了验证。与SNP rs2200733距离最近的已知基因是PITX2，该基因编码一个转录因子蛋白，动物实验已证实PITX2在房颤发生中起关键作用，敲低PITX2在小鼠心脏中的表达容易诱发房颤表型，但其致病机理尚不完全清楚。因此，为深入解析房颤的分子遗传学机制，本研究通过酵母双杂交系统来筛选在心脏中与PITX2相互作用的蛋白，为研究PITX2的致病机理提供分子生物学基础。实验首先以从ORIGENE公司购买的PITX2cDNA为模板，PCR扩增975bpPITX2c全长序列，构建诱饵载体pGBKT7-PITX2。将诱饵载体转化酵母细胞AH109，未发现有细胞毒性以及自激活现象。随后将已转化诱饵载体的酵母细胞Y187与人心脏cDNA文库进行Yeasting mating，通过营养缺陷型进行阳性克隆的筛选，后经多次营养筛选、X-β-gal显色反应分析等来排除假阳性克隆，最后共得到286个阳性克隆。我们对其中100个克隆进行了测序，测序结果通过NCBI和UCSC数据库中的BLAST工具进行同源比对，最后发现WDR6(Homo sapiens WD repeat-containing protein6)和ITLN1(Homo sapiens intelectin1(galactofuranose binding))可能是其中两个与PITX2存在相互作用的蛋白。下一步拟通过Co-IP、GST Pull down以及细胞共定位进行确认。总之，对这些蛋白与PITX2相互作用的最终确认可能将有助于揭示PITX2在心脏中的生理功能以及PITX2导致房颤的分子致病机理。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
1 绪论  8-15
  1.1 房颤的基础与临床研究  8-9
  1.2 PITX2 基因与遗传性疾病  9-10
  1.3 酵母双杂交与蛋白质之间相互作用  10-14
  1.4 酵母双杂交系统筛选与 PITX2 相互作用的蛋白质  14-15
2 材料与方法  15-34
  2.1 实验材料  15-22
  2.2 实验方法  22-34
3 实验结果  34-44
  3.1 PITX2 基因的克隆及 PGBKT7-PITX2 诱饵载体的构建  34
  3.2 PGBKT7-PITX2 诱饵载体的自激活检测  34-35
  3.3 WESTERN BLOT 检测 PITX2- BD 诱饵蛋白表达  35-36
  3.4 诱饵蛋白的毒性检测  36
  3.5 筛选与诱饵蛋白 PITX2-BD 相互作用的蛋白  36-44
4 讨论  44-48
5 总结与展望  48-49
致谢  49-50
参考文献  50-54
附录主要英文缩略词  54

应用酵母双杂交系统筛选与PITX2相互作用的蛋白

内容摘要

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