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伯氏疏螺旋体的莱姆关节炎相关毒力因子研究

作　者: 宝福凯
导　师: 陈明清
学　校:
专　业: 外科学
关键词: 伯氏疏螺旋体基因克隆莱姆关节炎 rBmpA 昆明(KM)小鼠动物模型致病机理炎症细胞因子基因组微阵列表达谱
分类号: R377
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究目的：1.用实时荧光定量PCR确定伯氏疏螺旋体感染小鼠模型不同组织的病原体载量,探讨组织螺旋体载量与相应组织病理损伤的关系。2.建立伯氏疏螺旋体感染的小鼠模型,通过DECAL和微阵歹(microarray)等技术研究伯氏疏螺旋体在小鼠关节组织中的关节特异性基因表达谱,寻找伯氏螺旋体在关节中特异性高表达的基因。3.以伯氏疏螺旋体标准株B31株基因组DNA为模板,PCR扩增在关节中特异性高表达的bmpA全基因序列,定向克隆和高效表达重组蛋白BmpA(rBmpA)并纯化。对伯氏疏螺旋体BmpA蛋白进行亚细胞定位研究。4.通过用重组伯氏疏螺旋体膜蛋白A (rBmpA)定期局部注射昆明(KM)小鼠胫跗关节,诱导并建立莱姆关节炎(Lyme arthritis)昆明(KM)小鼠模型,在此基础上,从形态学、影像学、病理学水平探索关节炎病变,检测莱姆关节炎小鼠血清及关节液中Th-17细胞相关细胞因子IL-6、TGF-β及IL-17细胞因子含量,探讨Th-17细胞在莱姆关节炎致病机制中作用。5.从免疫细胞和分子水平初步研究rBmpA的致病机理。研究内容：1.培养低传代伯氏疏螺旋体至对数生长期,稀释为1×105/ml。为建立伯氏疏螺旋体感染小鼠模型,于每只小鼠皮内注射菌液100μl,在证实感染成功后,于第12d和18d分别取不同组织,提取总DNA,用实时荧光定量PCR分别测定组织中的螺旋体flaB基因拷贝数,并标准化为每106β-肌动蛋白所对应的flaB拷贝数(螺旋体数)。对不同组织的螺旋体载量进行统计学处理,确定不同组织螺旋体载量是否有显著性差异。2.建立伯氏疏螺旋体感染小鼠模型,在不同时间点处死小鼠,收集小鼠关节、心脏、皮肤和膀胱组织,从四种组织中分别提取总RNA；随后,用DECAL技术和微阵列技术分析不同时间点伯氏疏螺旋体在四种组织中的转录组；最后,将伯氏疏螺旋体在关节中的转录组依次与其他三种组织中的转录组进行比较,从而获得伯氏疏螺旋体不同时间点的关节特异性基因表达谱,找出仅在关节中表达的伯氏疏螺旋体基因。3.(1) BmpA基因的定向克隆与重组菌的产生：以伯氏疏螺旋体标准株B31株基因组DNA为模板,设计定向克隆引物,PCR扩增bmpA全基因序列,将bmpA基因定向克隆入表达载体pGEX-6p-1,酶切鉴定,转化大肠杆菌BL21菌株,获得bmpA重组菌。(2)重组bmpA高效表达与纯化：从重组菌培养温度,诱导时间,诱导剂的剂量,OD600等方面优化诱导条件,找到高效表达重组bmpA的最佳方案。用GSH柱纯化重组bmpA,探索纯化bmpA的最佳条件。(3)bmpA的亚细胞定位研究。4.(1)研究rBmpA在诱导莱姆关节炎致病中作用：优化rBmpA注射浓度、剂量、次数,探索rBmpA在诱导莱姆关节炎中的致病作用。(2)尝试在新的动物品系(KM小鼠)、新方法(局部关节注射)建立莱姆关节炎动物模型的可能性：探索采取局部注射KM小鼠胫跗关节,建立莱姆关节炎模型的方法。(3)从形态学、影像学、病理学水平探索关节炎病变。(4)探讨Th-17细胞相关细胞因子IL-6、IL-17及TGF-β细胞因子在莱姆关节炎致病机理中作用：检测莱姆关节炎小鼠血清及关节液中与Th-17细胞相关细胞因子IL-6、IL-17及TGF-β细胞因子含量,探讨Th-17细胞在莱姆关节炎致病机制中作用。5.研究rBmpA对小鼠腹腔巨噬细胞和脾脏淋巴细胞的活化作用。研究结果：1.在所检测的4种代表性组织中,膀胱伯氏疏螺旋体载量在两个典型时间点均最高,皮肤和关节次之,心脏最低。2.与其他组织相比,在感染后第15天,伯氏疏螺旋体在小鼠关节组织特异地表达21个基因,其中13个基因位于伯氏疏螺旋体染色体上,8个基因位于质粒上；在感染后的第105天,伯氏疏螺旋体在小鼠关节组织特异地表达24个基因,其中13个基因位于伯氏疏螺旋体染色体上,11个基因位于质粒上。在关节中表达最高的是bmpA、bmpB等基因。3. bmpA基因的克隆与表达研究。(1)在基因水平和蛋白水平上,都出现了目的条带和目标峰,确定表达载体bmpA-pGEX-6p-1构建成功,并表达重组bmpA。(2)通过分析比较,重组质粒在37℃, IPTG诱导浓度为0.1mmol/ml,诱导时间为6小时,菌液的0D值为0.5-1.0以及在LB培养基上培养GST-bmpA融合蛋白表达量达到最大。(3)在最佳表达条件下1L的重组菌能纯化到2.9-3.1mg的bmpA蛋白。(4)亚细胞定位研究表明,BmpA存在于螺旋体表面。4. BmpA诱导关节炎研究。(1)用rBmpA稀释液局部注射KM小鼠胫跗关节,成功建立了莱姆关节炎(Lyme arthritis)-昆明(KM)小鼠模型,拓展了新的莱姆关节炎动物造模方法。(2)从形态学、影像学、病理学水平证实rBmpA与莱姆关节炎发病密切相关。(3)检测莱姆关节炎小鼠血清及关节液中与Th-17细胞相关细胞因子IL-6、IL-17及TGF-β细胞因子含量与对照组及正常组比较无明显统计学意义,分析和探讨了相关原因,为未来进一步研究奠定了基础。5. rBmpA对小鼠腹腔巨噬细胞的作用不明显,但对小鼠脾淋巴细胞有明显的刺激增殖作用,并可以刺激脾淋巴细胞产生炎性细胞因子白细胞介素6。结论：1.伯氏疏螺旋体感染小鼠后,不同组织螺旋体载量有显著性差异,膀胱螺旋体载量在两个典型时间点均最高,皮肤和关节次之,心脏最低。组织螺旋体载量与组织损伤程度无密切关系。2.伯氏疏螺旋体在小鼠关节组织中存在独特的基因表达谱,其中螺旋体膜蛋白基因bmpA和bmpB在关节表达最高。这些在关节中特异表达的基因可能与莱姆关节炎的发生、发展有关。3.(1)成功的构建了表达重组蛋白bmpA的大肠杆菌原核表达系统,并且在基因水平和蛋白水平上得到鉴定。(2)找到了高效表达重组BmpA的最佳方案。用GSH柱纯化重组BmpA,探索出纯化重组BmpA的最适条件。(3)亚细胞定位研究表明,BmpA存在于螺旋体细胞外膜表面。4.(1)用rBmpA稀释液局部注射KM小鼠胫跗关节,成功建立了莱姆关节炎(Lyme arthritis)-昆明(KM)小鼠模型。(2)rBmpA与莱姆关节炎发病密切相关。5. rBmpA对小鼠脾淋巴细胞有明显的刺激增殖作用,并可以刺激脾淋巴细胞产生炎性细胞因子白细胞介素6。

全文目录

中文摘要  5-9
Abstract  9-13
相关缩略词  13-14
引言  14-20
  参考文献  18-20
第一章伯氏疏螺旋体感染动物模型中螺旋体组织载量的定量研究  20-30
  摘要  20
  Abstract  20-21
  1 材料和方法  21-25
  2 结果  25-27
  3 讨论  27-28
  参考文献  28-30
第二章伯氏螺旋体在小鼠宿主中的关节特异性转录谱  30-48
  摘要  30
  Abstract  30-33
  1. Materials and Methods  33-36
  2. Results  36-42
  3. Discussion  42-45
  References  45-48
第三章莱姆病螺旋体膜蛋白bmpA的分子克隆和亚细胞定位研究  48-81
  中文摘要  48-49
  Abstract  49-51
  相关缩略词  51-52
  前言  52-55
  一. 实验材料  55-61
  二. 实验方法  61-65
  三. 实验结果  65-73
  四. 讨论  73-74
  五. 结论  74-76
  参考文献  76-81
第四章莱姆病螺旋体膜蛋白bmpA的致关节炎作用研究  81-117
  中文摘要  81-83
  Abstract  83-85
  相关缩略词  85-86
  前言  86-89
  一、动物模型建立与体内研究  89-109
  二、结果  109-110
  三、讨论  110-113
  参考文献  113-117
讨论  117-125
本博士学位论文的创新点  125-126
参考文献  126-138
文献综述-莱姆病和莱姆关节炎研究进展  138-219
  (一) 莱姆病治疗研究进展  138-147
    参考文献  145-147
  (二) 莱姆关节炎发病机理研究进展  147-156
    参考文献  153-156
  (三) 伯氏疏螺旋体膜蛋白BmpA研究进展  156-163
    参考文献  160-163
  (四) Th17与莱姆关节炎发病关系的研究进展  163-172
    参考文献  168-172
  (五) The pathogen-vector interact ions during Borreliaburgdorferitransmission  172-190
    References  184-190
  (六) 神经莱姆病的研究进展  190-198
    参考文献  195-198
  (七) 莱姆病诊断技术研究进展  198-219
    参考文献  211-219
攻读学位期间发表的相关论文  219-221
致谢  221

伯氏疏螺旋体的莱姆关节炎相关毒力因子研究

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