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表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对昆明小鼠新鲜/冻融精子体外受精胚胎发育的影响

作　者: 刘婉敏
导　师: 李志凌
学　校: 汕头大学
专　业: 临床医学
关键词: 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 体外受精(IVF) 体外培养胚胎发育昆明(KM)小鼠
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

前言辅助生殖技术(assisted reproductive techniques, ART)目前已成为不孕夫妇孕育下一代的重要治疗措施,然而ART中,如精液冷冻、体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术的应用,可产生较体内更高水平的活性氧类物质(reactive oxidative species,ROS),使配子或胚胎细胞处于氧化应激状态(oxidative stress),诱发其发生线粒体改变、DNA损伤、胚胎发育延迟或阻滞等一系列氧化应激性损伤。目前,ROS已被认为是体外培养胚胎丢失的主要原因,而ART应用过程中胚胎细胞的抗氧化损伤保护及氧化损伤后修复亦引起了人们重视。在体外受精培养体系中添加抗氧化剂是增加胚胎细胞抗氧化损伤保护的有效措施之一,遗憾的是目前尚未找到一种理想的抗氧化剂。近年来,茶因其健康效益而备受关注,研究发现绿茶提取物中活性最强的儿茶素单体——表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是一种良好的抗氧化剂,不仅具有抑制和清除氧自由基、螯合金属离子的作用,还呈现高度的氧化还原力;而且具有影响修复系统,促进DNA损伤修复、抗突变、抗肿瘤等多种功能。由于动物体内实验提示孕鼠EGCG灌胃后,EGCG能分布至胎儿多个器官,而且EGCG没有明显直接的胚胎-胎儿毒性和致畸性,因而EGCG被认为是一种较理想的抗氧化剂,EGCG在ART中的应用也开始引起关注,但目前研究仍非常有限。目的1.分析EGCG对昆明(KM)小鼠新鲜/冻融精子体外受精胚胎发育的影响。2.探讨EGCG应用于体外受精胚胎培养体系的安全性。方法1.分别在体外受精培养体系的受精液、胚胎发育培养液中添加不同浓度的EGCG(0、5、10、15、25μg/ml);或同时在受精液、胚胎发育培养液中添加不同浓度的EGCG(0、5、10、15、25μg/ml),观察和比较KM小鼠新鲜精子体外受精的受精率和胚胎发育能力(卵裂率、囊胚形成率和优质4-细胞胚胎率)。2.同时在体外受精培养体系的受精液和胚胎发育培养液中添加不同浓度的EGCG(0、10、17.5、25、50μg/ml),观察和比较KM小鼠冻融精子体外受精的受精率和胚胎发育能力(卵裂率、4-细胞胚胎形成率、优质4-细胞胚胎率和囊胚形成率)。结果1.与对照组(EGCG 0μg/ml)相比,体外受精培养体系中添加10μg/ml EGCG后,明显提高了KM小鼠新鲜精子体外受精的囊胚形成率和优质4-细胞胚胎率(P<0.05 ;P<0.05)。三种EGCG添加方式:受精液单独添加,胚胎发育培养液单独添加,或受精液和胚胎发育培养液同时添加,对体外受精结局均存在有利影响,以最后一种添加方式更明显,但差异无统计学意义(P>0.05)。然而当受精液中EGCG添加浓度增加至25μg/ml时,反而明显降低了小鼠的受精率(P<0.05);胚胎发育培养液中添加25μg/ml EGCG时,卵裂率下降明显(P<0.01);而且均未发现4-细胞胚胎和囊胚形成。此外,5、15、20μg/ml EGCG添加浓度,对小鼠体外受精的影响不明显,与对照组相比,受精率、卵裂率、囊胚形成率和优质4-细胞胚胎率四项观察指标的变化均无统计学意义(P>0.05)。2. KM小鼠精子冷冻复苏后,活率和活力都发生了下降;而且冻融精子组的体外受精率和卵裂率、囊胚形成率均比新鲜精子组低,差别有统计学意义(P<0.05;P<0.05;P<0.05)。与对照组(EGCG 0μg/ml)相比,当KM小鼠冻融精子体外受精培养体系中添加10、17.5μg/ml EGCG后,均能提高体外受精的受精率,卵裂率,4-细胞胚胎形成率,优质4-细胞胚胎率和囊胚形成率,其中受精率和优质4-细胞胚胎率的提高有统计学意义(P<0.05;P<0.05),以17.5μg/ml添加浓度效果更明显。25μg/ml EGCG添加浓度对KM小鼠冻融精子体外受精的影响不明显,各项观察指标的变化无统计学意义(P>0.05)。当添加浓度增加至50μg/ml时,未观察到有受精卵形成。结论1. KM小鼠体外受精培养体系中添加适宜浓度的EGCG可提高新鲜精子体外受精的囊胚形成率和优质4-细胞胚胎率,促进胚胎发育。然而高浓度的EGCG却可导致KM小鼠新鲜体外受精率明显下降,并引起胚胎发育阻滞。即EGCG对体外受精胚胎发育随着添加浓度的变化存在有利和有害的影响。EGCG应用时必须注意其安全性。2.采用受精液和配胚胎发育培养液同时添加抗氧化剂方式,即抗氧化损伤保护措施尽量贯穿整个体外受精、种植前胚胎发育培养过程,可能更有利于保护胚胎细胞和促进胚胎细胞的发育。3. KM小鼠体外受精培养体系中添加适宜浓度的EGCG对冻融精子体外受精胚胎发育存在有利影响;当EGCG添加浓度超过适宜范围时反而阻碍了冻融精子体外受精胚胎发育。4.与新鲜精子相比,冻融精子体外受精时更须注意采用抗氧化损伤的保护措施。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
缩略词表  11-14
第一部分 EGCG 对 KM 小鼠新鲜精子体外受精胚胎发育的影响  14-37
  第1章前言  14-17
  第2章材料与方法  17-25
    2.1 研究对象  17
    2.2 主要试剂及实验仪器  17-18
    2.3 实验方法  18-21
    2.4 受精及胚胎质量评估  21
    2.5 实验设计  21-22
    2.6 统计分析  22-25
  第3章结果  25-33
    3.1 受精液中添加不同浓度EGCG 对KM 小鼠体外受精胚胎发育的影响  25-26
    3.2 胚胎发育培养液中添加不同浓度 EGCG 对 KM 小鼠体外受精胚胎发育的影响  26-28
    3.3 受精液、胚胎发育培养液同时添加不同浓度 EGCG 对 KM 小鼠体外受精胚胎发育的影响  28-29
    3.4 体外受精过程不同阶段培养液添加 EGCG(10μg/ml)对 KM 小鼠体外受精胚胎发育的影响  29-33
  第4章讨论  33-36
  第5章结论  36-37
第二部分 EGCG 对KM 小鼠冻融精子体外受精胚胎发育的影响  37-48
  第1章前言  37-38
  第2章材料与方法  38-41
    2.1 研究对象  38
    2.2 主要试剂及实验仪器  38
    2.3 实验方法  38-40
    2.4 受精及胚胎质量评估  40
    2.5 实验设计  40
    2.6 统计分析  40-41
  第3章结果  41-44
    3.1 KM 小鼠精子冷冻效果  41
    3.2 冻融/新鲜精子体外受精分析  41-42
    3.3 EGCG 对 KM 小鼠冻融精子体外受精的影响  42-44
  第4章讨论  44-47
  第5章结论  47-48
展望  48-49
参考文献  49-55
综述一受精卵内γH2AX介导的精子DNA损伤修复研究  55-66
综述二影响DNA损伤修复的受精卵特点  66-76
附录  76-77
致谢  77

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对昆明小鼠新鲜/冻融精子体外受精胚胎发育的影响

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