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香鱼核转录抑制因子PaIκBα克隆与表达

作　者: 张文青
导　师: 龚一富
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 香鱼 PaIκBα 克隆生物信息学分析基因表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究利用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）技术克隆得到香鱼核转录抑制因子PaIκBα基因的全长cDNA序列，PaIκBα全长序列为1341bp，开放阅读框ORF为936bp，编码311个氨基酸，5’非编码区为64bp，3’非编码区为341bp。同源性比对结果表明，香鱼IκBα基因与胡瓜鱼IκBα基因的同源性最高，为95%；其次是大西洋鲑、虹鳟、尼罗罗非鱼和鳜鱼等，同源性分别为76%、75%、70%和68%。利用vector NTI Suite7.0对香鱼IκBα和其他7种鱼的IκBα蛋白进行多序列比对。结果显示，核转录抑制因子IκBα在进化上比较保守，PaIκBα的降解单元为DSGLES，两个亲水性氨基酸L和E分别代替IκBα的保守降解单元DSGXXS中的两个XX，其中丝氨酸35和丝氨酸39是其磷酸化位点；PaIκBα的中间部分有五个保守的长度大约30个氨基酸的锚蛋白重复序列；C端有保守的PEST结构域，包含P（脯氨酸）、E（谷氨酸）、D（天冬氨酸）和S（丝氨酸）。利用ProtParam软件对PaIκBα蛋白进行基本特性分析，结果显示PaIκBα理论等电点（pI）为4.83，计算分子量为35137.2。在氨基酸组成上，亮氨酸数目最多，其次是谷氨酸，其他氨基酸含量较少。总的带负电荷的氨基酸残基数和总的带正电荷的氨基酸残基数分别为50个和25个。预测PaIκBα蛋白的不稳定指数为49.82，分类属于不稳定蛋白。PaIκBα的亲水性分析数值为87.49，为亲水性蛋白。TMHMM程序分析PaIκBα不存在跨膜结构。利用在线分析软件SOPMA对PaIκBα进行二级结构分析，结果表明该蛋白主要形成4种二级结构形式，分别是α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠和β-转角。EpiLoc亚细胞定位分析显示，PaIκBα蛋白主要位于细胞质中。ExPASy NetPhos预测PaIκBα氨基酸磷酸化位点，结果显示PaIκBα有11个Ser位点，1个Thr位点和5个Tyr位点。SWISS-MODEL软件中的3维结构模型展示了香鱼核转录抑制因子的空间结构，PaIκBα蛋白的α-螺旋结构通过β-折叠在空间规则的平行排列，其中α-螺旋结构具有PaIκBα的特征结构序列——五个锚蛋白重复序。系统进化树分析显示，IκBα蛋白具有明显的种族特异性，进化树按种属间亲缘关系的远近分为五个大的分支。其中，香鱼与亲缘关系较近的胡瓜鱼（Osmerus mordax）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、尼罗罗非鱼（Nile tilapia）、鳜鱼（Siniperca chuatsi）、白斑狗鱼（Esox lucius）、大西洋鲑（Salmo salar）和斑马鱼（Danio rerio）等鱼类形成一个独立分支。IκBα的进化程度与物种分类地位保持一致，这表明了不同物种来源的核转录抑制因子在进化上是保守的。One-step RT-PCR分析PaIκBα在香鱼不同组织中的分布显示，香鱼的肝脏、肾脏、脾脏和鳃中PaIκBα表达水平较高，其次是肠、脑和肌肉，在心脏中表达最少。嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗利斯顿氏菌和副溶血弧菌感染香鱼后，PaIκBα在香鱼肝脏中呈现时间依赖性表达趋势，在感染后表达量逐渐上升，达到最大值后转录水平下降，PaIκBα对脂多糖的刺激非常敏感，表达在2h即可达到最大值，试验组比空白组和对照组表达显著性增加。氯化钠对香鱼PaIκBα基因的表达影响不明显，除了在24h，试验组比对照组PaIκBα的表达明显增加外，其他的时间点均无显著性差异。给香鱼饲喂黄芪多糖3天后，试验组香鱼PaIκBα的转录水平上升，到第9天PaIκBα的转录水平达到最大值，试验组和对照组相比，PaIκBα的表达量显著性增加，而后PaIκBα的转录逐渐下调。半定量技术检测香鱼受到细菌感染、脂多糖、氯化钠刺激及黄芪多糖饲喂后肝脏中PaIκBα的表达模式表明PaIκBα在香鱼的免疫过程中可能发挥着重要的作用。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
1 绪论  13-26
  1.1 香鱼的生物学特性  13-14
  1.2 香鱼养殖中的病害  14-16
    1.2.1 香鱼寄生虫病  14-15
    1.2.2 香鱼细菌性疾病  15-16
    1.2.3 香鱼真菌性疾病  16
  1.3 NFκB/IκB 家族  16-22
    1.3.1 NF-κB 蛋白家族及其结构特征  17-19
    1.3.2 IκB 蛋白家族及其结构特征  19-20
    1.3.3 I-κK 蛋白家族及其结构特征  20-22
  1.4 NF-κB 信号转导机制  22-26
    1.4.1 TNFα介导的 NF-κB 信号通路  23
    1.4.2 IL-1Rs/TLRs 介导的 NF-κB 信号通路  23-24
    1.4.3 T 细胞受体介导的 NF-κB 激活  24
    1.4.4 B 细胞受体介导的 NF-κB 激活  24
    1.4.5 旁路 NF-κB 途径  24-26
2 香鱼 PaIκBα 的基因克隆  26-38
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 实验动物  26
    2.1.2 酶与试剂盒  26
    2.1.3 引物  26
    2.1.4 培养基及常用试剂配制  26-27
    2.1.5 菌株和载体  27
    2.1.6 实验仪器  27
    2.1.7 多序列比对和进化树分析中用到的各物种 IκBα 的氨基酸序列  27-28
  2.2 实验方法  28-34
    2.2.1 香鱼 RNA 的提取  28-29
    2.2.2 转录合成香鱼 cDNA 第一链  29
    2.2.3 目的基因 PaIκBα 的核心片段扩增  29-30
    2.2.4 切胶回收目的基因 PaIκBα  30-31
    2.2.5 PCR 产物回收纯化后与 pMd19-Tvector 的连接  31
    2.2.6 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞  31
    2.2.7 重组质粒的转化  31-32
    2.2.8 菌落 PCR 鉴定  32
    2.2.9 测序  32
    2.2.10 RACE cDNA 文库的构建  32-33
    2.2.11 RACE 法扩增 PaIκBα 基因的 3’末端序列  33-34
    2.2.12 RACE 法扩增 PaIκBα 基因的 5’末端序列  34
    2.2.13 PaIκBα 基因全长序列的获得  34
  2.3 结果与分析  34-38
    2.3.1 香鱼总 RNA 提取及检测  34-35
    2.3.2 核心片段克隆  35-36
    2.3.3 3’-RACE 结果和 5’-RACE 结果  36-37
    2.3.4 全长序列  37-38
3 香鱼 PaIκBα 序列生物信息学分析  38-49
  3.1 PaIκBα 同源性分析  38-41
  3.2 香鱼 PaIκBα 一级结构分析  41
  3.3 香鱼 PaIκBα 二级结构分析  41-42
  3.4 香鱼 PaIκBα 三级结构分析  42-43
  3.5 PaIκBα 跨膜结构分析  43-44
  3.6 PaIκBα 结构域分析  44
  3.7 PaIκBα 亚细胞定位分析  44
  3.8 PaIκBα 信号肽预测分析  44-45
  3.9 PaIκBα 磷酸化位点预测  45
  3.10 香鱼 PaIκBα 系统进化树建立  45-47
  3.11 讨论  47-49
4 半定量技术检测 PaIκBα 基因的表达模式  49-61
  4.1 实验材料  49
    4.1.1 实验动物  49
    4.1.2 实验所用菌种等材料  49
  4.2 实验方法  49-52
    4.2.1 香鱼各组织解剖及总 RNA 提取  49
    4.2.2 半定量技术分析 PaIκBα 的组织表达差异  49-51
    4.2.3 病原刺激实验  51
    4.2.4 脂多糖刺激试验  51-52
    4.2.5 氯化钠刺激试验  52
    4.2.6 黄芪多糖试验  52
    4.2.7 半定量检测 PaIκBα 在香鱼肝脏的表达模式分析  52
  4.3 实验结果  52-61
    4.3.1 总 RNA 提取及检测  52
    4.3.2 香鱼 PaIκBα 基因 mRNA 的组织表达特征  52-53
    4.3.3 不同处理对香鱼 PaIκBα 基因的表达模式分析  53-57
    4.3.4 讨论  57-61
5 结论  61-64
  5.1 香鱼核转录抑制因子 PaIκBα 的序列克隆  61
  5.2 半定量检测 PaIκBα 的表达模式  61-62
  5.3 半定量 RT-PCR 与荧光定量 PCR  62-64
参考文献  64-77
在学研究成果  77-79
致谢  79

香鱼核转录抑制因子PaIκBα克隆与表达

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