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家蚕BmARM-like基因的克隆、表达与亚细胞定位研究

作　者: 尤征英
导　师: 徐家萍
学　校: 安徽农业大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕 BmARM-like基因表达分析 Real-time PCR Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统亚细胞定位
分类号: S881.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本项目的前期研究工作通过荧光差异显示技术，比较分析了家蚕(Bombyx mori)对BmNPV不同抗性品系基因表达的差异，获得了一个差异表达的片段。本研究通过在家蚕数据库中的比对，获得了该片段所在基因的完整ORF框，分析该基因为一新基因，在家蚕中未有研究报道，定名为BmARM-like基因，GenBank登录号为：JF500112，对该基因进行克隆、测序、序列分析、原核表达，并对该基因进行了时空表达及亚细胞定位研究，结果如下：1.运用数据库分析BmARM-like基因的功能域，该基因含有一个Armadillo/beta-catenin-like repeat (ARM)结构和两个HEAT结构，根据有关文献报道ARM有可能参与Wnt信号途径的转导。根据BmARM-like基因的完整ORF的序列设计特异引物，通过RT-PCR方法扩增获得该基因编码框序列，其ORF为1923bp，编码640个氨基酸，其氨基酸序列与蜜蜂、果蝇、人和家鼠相似氨基酸同源性分别为32.50,24.53,22.27和19.11%。2.将BmARM-like基因片段亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)上，转化到BL21（DE3）感受态菌在大肠杆菌中，诱导表达，并对表达的重组蛋白纯化，制备了该重组蛋白的兔多克隆抗体。3.运用Real-time PCR的方法分析了家蚕BmARM-like基因在P50和A35五龄三天幼虫的中肠、脂肪体、血液、精巢、卵巢和头六个组织的表达以及P50的不同发育阶段新产下三天的卵、幼虫、蛹和蛾的表达情况，结果表明：家蚕BmARM-like基因在P50和A35两品种中的同一组织表达量是有差异的，并且在同一品种的不同组织中家蚕BmARM-like基因的表达量也是有差异的；不同的发育阶段，卵的表达量较低，幼虫时表达量达到最大值，随后经过蛹、蛾又逐渐降低；而通过抗性水平检测实验表明A35对BmNPV的抗性高于P50，推测该基因表达产物有可能通过家蚕的血液组织抑制病毒的不同形式有关。4.为了研究BmARM-like基因产物在病毒感染环境下细胞中的定位，将BmARM-like片段与EGFP报告基因融合，用杆状病毒表达系统构建了重组病毒：通过病毒感染观察，发现荧光信号主要定位于家蚕细胞的细胞核内，但细胞质和细胞膜上也有微弱的荧光信号。通过以上研究结果表明， BmARM-like基因在mRNA水平上主要在家蚕的中肠及血液组织中高表达，这与家蚕抗病毒的免疫组织主要是中肠和血液相一致；BmARM-like基因的表达产物主要定位在细胞核中，有可能参与一些重要的信号途径的转导相关。因此，本文的研究为进一步揭示BmARM-like基因产物的具体功能奠定了基础。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
文献综述  9-19
  1 家蚕功能基因研究  9-13
    1.1 家蚕功能基因研究现状  9-10
    1.2 家蚕蛋白质组研究进展  10-11
    1.3 家蚕核型多角体病的抗性机制研究  11-13
  2 Armadillo 蛋白概述  13-15
    2.1 Armadillo 蛋白研究进展  13
    2.2 Armadillo蛋白的进化与功能  13-15
  3 相关实验技术介绍  15-19
    3.1 大肠杆菌表达载体系统  15-16
    3.2 荧光定量PCR技术  16
    3.3 杆状病毒表达系统  16-19
1 引言  19-21
  1.1 研究的目的  19
  1.2 研究的意义  19
  1.3 研究的内容  19-20
  1.4 技术路线  20-21
2 材料和方法  21-42
  2.1 实验材料  21-26
    2.1.1 质粒、菌株和试剂  21
    2.1.2 家蚕品种和细胞  21
    2.1.3 常用缓冲液及试剂配方  21-25
    2.1.4 培养基  25-26
    2.1.5 主要仪器设备  26
  2.2 方法  26-42
    2.2.1 P50 与A35 两家蚕品种LC50 的测定  26-27
    2.2.2 家蚕BmARM-like基因的克隆及序列生物信息学分析  27-31
    2.2.3 家蚕BmARM-like基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备  31-35
    2.2.4 家蚕BmARM-like基因的时空表达  35-36
    2.2.5 家蚕BmARM-like基因表达产物的亚细胞定位  36-42
3 结果与分析  42-57
  3.1 不同家蚕品种抗性测定结果  42
  3.2 家蚕BmARM-like基因的克隆与生物信息学分析  42-47
    3.2.1 总RNA的制备  42
    3.2.2 BmARM-like基因完整ORF片段的PCR鉴定  42-43
    3.2.3 BmARM-like基因片段的T-A克隆  43
    3.2.4 BmARM-like基因序列的生物信息学分析  43-47
  3.3 家蚕BmARM-like基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备  47-50
    3.3.1 重组质粒的酶切鉴定  47-48
    3.3.2 重组蛋白的表达与纯化  48-49
    3.3.3 多克隆抗体制备及Western blot分析  49-50
  3.4 家蚕BmARM-like基因的时空表达  50-52
    3.4.1 扩增产物溶解曲线分析  50
    3.4.2 BmARM-like基因在不同发育组织及不同阶段的表达分析  50-52
  3.5 家蚕BmARM-like基因表达产物的亚细胞定位  52-57
    3.5.1 EGFP片段的鉴定  52-53
    3.5.2 重组转座载体pFastBac1/BmARM-like/EGFP的酶切鉴定  53
    3.5.3 重组杆粒的鉴定  53-54
    3.5.4 重组病毒上清液的PCR鉴定  54-55
    3.5.5 BmARM-like-EGFP融合蛋白的亚细胞定位  55-56
    3.5.6 BmARM-like-EGFP融合蛋白的Western blot验证  56-57
4 讨论  57-59
5 结论及工作展望  59-61
  5.1 主要结论  59-60
  5.2 工作展望  60-61
参考文献  61-66
致谢  66-67
个人简介  67
在学期间发表论文  67

家蚕BmARM-like基因的克隆、表达与亚细胞定位研究

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