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腺病毒介导山羊PTHrP基因在乳腺上皮细胞中的表达及其功能研究

作　者: 陈巧玲
导　师: 郑惠玲
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 遗传学
关键词: 山羊 腺病毒载体 乳腺上皮细胞 PTHrP 钙代谢
分类号: S858.27
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


PTHrP在正常细胞和恶性肿瘤细胞中产生并分泌,是细胞和器官生长、发育、迁移、分化和生存的重要调节因子。而且它还是上皮细胞钙离子运输过程中的关键调节因子,在调节乳钙代谢中起着重要作用。△FosB、S100A4、S1O0A13、Smad4、Runx2和Stat5a基因都在乳腺上皮细胞中有表达并且与钙代谢有一定的关系,为了探究PTHrP基因与这几个钙代谢相关基因之间的关系,本研究利用Adeasy-1腺病毒系统,构建、包装并鉴定了PTHrP基因的超表达重组腺病毒。并利用PTHrP基因的超表达重组腺病毒和课题组以前制备的干扰表达PTHrP基因的重组腺病毒,分别感染山羊乳腺上皮细胞,用实时荧光定量PCR方法研究在山羊乳腺上皮细胞中超表达和干扰表达PTHrP基因后,几个钙代谢相关基因的mRNA表达变化,为进一步研究PTHrP基因在乳腺中调节钙代谢的分子作用机制积累资料。获得主要结果如下：(1)构建并鉴定PTHrP基因的超表达重组腺病毒载体pAdEasy-CMV-PTHrP和对照空载体pAdEasy-CMV,将质粒线性化后转染HEK-293细胞,包装并扩增出高滴度的PTHrP重组腺病毒Ad-PTHrP和AdEasy-CMV,滴度分别为1.6×109U/mL和1.0×109U/mL。(2)用Ad-PTHrP和AdEasy-CMV感染山羊乳腺上皮细胞,确定了最佳MOI=200。(3)实时荧光定量PCR检测表明Ad-PTHrP感染山羊原代乳腺上皮细胞24h、48h、72h后,PTHrP基因mRNA表达量分别增加了104倍、230倍、和520倍(P<0.01),相应的Western Blot检测结果表明乳腺上皮细胞中PTHrP蛋白表达也升高,表明Ad-PTHrP重组腺病毒过表达PTHrP的效果显著。(4)用Ad-PTHrP和干扰表达重组腺病毒Ad-PTHrP-322分别感染乳腺上皮细胞24h、48h、72h后,用实时定量PCR方法检测钙代谢相关基因△FosB、S100A4、S100A13、 Smad4、Runx2和stat5a基因的mRNA表达水平,结果表明,随着PTHrP表达量升高,△FosB、Smad4、Runx2基因的mRNA表达有不同程度的降低,S100A4、S100A13基因的mRNA表达水平升高；随着PTHrP表达量降低,△FosB、Smad4、Runx2基因的mRNA表达水平升高,S100A4、S100A13基因的mRNA表达水平降低,无论PTHrP上升或下降,stat5a基因表达没有变化。综上所述,本研究成功构建并制备了能够过表达PTHrP的重组腺病毒。PTHrP基因对△FosB、Smad4、Runx2基因的mRNA表达有正调控作用,对S100A4、S100A13基因的mRNA表达有负调控作用,对stat5a基因的mRNA表达没有调控作用。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
第一章 文献综述  12-26
  1.1 PTHrP基因的研究进展  12-16
    1.1.1 PTHrP基因概况  12-13
    1.1.2 PTHrP蛋白和受体  13-14
    1.1.3 PTHrP的生物学作用  14-16
  1.2 PTHrP等几个基因在钙代谢方面的研究进展  16-23
    1.2.1 PTHrP基因在骨骼钙代谢中的作用  16-18
    1.2.2 PTHrP基因在乳腺钙代谢中的作用  18-20
    1.2.3 △FosB、S100A4、S100A13、Smad4、Runx2和Stat5a基因在钙代谢中的作用  20-23
  1.3 腺病毒载体的研究进展  23-24
    1.3.1 腺病毒的基本结构  23
    1.3.2 腺病毒载体的发展简介  23-24
    1.3.3 腺病毒载体的构建及优点  24
  1.4 本研究的目的和意义  24-26
第二章 靶向山羊PTHrP基因的超表达重组腺病毒载体的构建与鉴定  26-37
  2.1 试验材料  26-27
    2.1.1 主要仪器设备  26
    2.1.2 试验材料  26
    2.1.3 主要试剂配方  26-27
  2.2 试验方法  27-34
    2.2.1 克隆载体pMD19-T-PTHrP的构建  27-32
    2.2.2 腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-PTHrP的构建与鉴定  32-33
    2.2.3 重组质粒pAdEasy-CMV-PTHrP和pAdEasy-CMV的构建、鉴定及扩增  33-34
  2.3 结果与分析  34-35
    2.3.1 克隆载体pMD19-T-PTHrP的构建  34
    2.3.2 腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-PTHrP的构建与鉴定  34-35
    2.3.3 重组质粒pAdEasy-CMV-PTHrP的构建及鉴定  35
  2.4 讨论  35-36
    2.4.1 山羊PTHrP基因的克隆  35-36
    2.4.2 重组腺病毒载体的构建  36
  2.5 小结  36-37
第三章 山羊PTHrP基因超表达腺病毒的制备与效率检测  37-48
  3.1 试验材料  37-39
    3.1.1 主要仪器设备  37
    3.1.2 试验材料  37-38
    3.1.3 主要试剂配方  38-39
  3.2 试验方法  39-44
    3.2.1 PTHrP超表达重组腺病毒的包装与扩增  39-41
    3.2.2 PTHrP超表达重组腺病毒的滴度测定  41
    3.2.3 PTHrP超表达重组腺病毒感染山羊乳腺上皮细胞  41
    3.2.4 PTHrP重组腺病毒超表达效率的检测  41-44
  3.3 试验结果与分析  44-46
    3.3.1 PTHrP超表达重组腺病毒的包装、扩增及滴度测定  44
    3.3.2 PTHrP超表达病毒液的PCR鉴定  44-45
    3.3.3 PTHrP超表达重组腺病毒最佳感染剂量的测定  45
    3.3.4 PTHrP超表达重组腺病毒效率的检测  45-46
  3.4 讨论  46-47
    3.4.1 PTHrP超表达重组腺病毒的包装、扩增及滴度测定  46-47
    3.4.2 PTHrP超表达重组腺病毒效率的检测  47
  3.5 小结  47-48
第四章 山羊PTHrP基因对钙代谢相关基因表达的影响  48-54
  4.1 试验材料  48
    4.1.1 主要仪器设备  48
    4.1.2 试验材料  48
  4.2 试验方法  48-50
    4.2.1 PTHrP超表达重组腺病毒和干扰重组腺病毒感染山羊乳腺上皮细胞  48-49
    4.2.2 RT-qPCR检测PTHrP超表达和低表达对钙代谢相关基因的影响  49-50
  4.3 结果与分析  50-52
    4.3.1 乳腺上皮细胞中总RNA提取  50
    4.3.2 RT-qPCR检测PTHrP对钙代谢相关基因表达的影响  50-52
  4.4 讨论  52-53
  4.5 小结  53-54
结论  54-55
参考文献  55-65
缩略词  65-66
致谢  66-67
作者简介  67

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 山羊
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