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山羊早期胚胎发育过程中胚胎干细胞标记分子的表达检测

作　者: 俞晓丽
导　师: 马保华；王华岩
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: OCT4 NANOG SOX2 CDX2 早期胚胎山羊
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胚胎干细胞(ESCs)是从囊胚内细胞团分离出来的细胞,这些细胞经体外培养后仍具有维持自我更新和多能性的特性。转录因子OCT4, NANOG和SOX2在维持动物胚胎干细胞的自我更新和多能性机制中伴有很重要的角色,它们在哺乳动物早期发育的胚胎中的表达呈现出不同空间(细胞定位),时间(发育点)分布。系统地了解转录调控是掌握动物胚胎发育和生产转基因动物的基础。本研究通过体内超数排卵和体外成熟卵母细胞孤雌激活的方法获得了山羊体内发育和孤雌激活早期胚胎,用实时定量PCR和免疫细胞化学方法检测了山羊早期胚胎的表达情况。结果如下:(1)经超数排卵共获得关中奶山羊体内发育胚胎231枚,其中2-细胞87枚,4-细胞12枚,8~16-细胞38枚,桑椹胚102枚,囊胚30枚,平均每只供体母羊获得胚胎13.5枚。同时获得了32枚体内成熟卵母细胞。经卵母细胞体外成熟培养和成熟卵母细胞孤雌激活后获得242枚孤雌胚胎,其中2-细胞87枚,4-细胞53枚,8-细胞46枚,桑椹胚40枚,囊胚16枚,并获得了15枚成熟卵母细胞。(2)用实时定量PCR和免疫细胞化学检测山羊体内成熟卵母细胞和体内胚胎发育过程中转录因子表达情况。结果发现,转录因子OCT4, NANOG和SOX2在成熟卵母细胞和早期胚胎中都有表达。OCT4 mRNA从卵母细胞到囊胚发育的过程中持续表达,其表达水平在胚胎发育过程中出现波动,卵母细胞、4-细胞胚胎和桑椹胚阶段表达水平较高,而在2-细胞、8-细胞和囊胚阶段则表现低水平表达。OCT4蛋白的表达从卵母细胞、2-细胞、4-细胞和8-细胞的胞质定位;在致密桑椹胚阶段处于胚胎外围的卵裂球同时表现胞质定位和核定位,而处于胚胎中心位置的卵裂球仍表现为胞质定位;到囊胚阶段的内细胞团细胞为胞质定位,滋养外胚层细胞中则为胞质定位和核定位。暗示从桑椹胚阶段开始发挥其生物学作用,其功能与桑椹胚致密化和胚胎细胞分化有关。NANOG的mRNA表达量从2-细胞阶段开始逐渐上升,桑椹胚时达到峰值,之后于囊胚阶段稍有下降;NANOG蛋白在8-细胞前为卵裂球胞质定位,8-细胞阶段开始出现核定位,桑椹胚和囊胚阶段的定位与OCT4类似。SOX2 mRNA的表达规律与NANOG类似,在8-细胞及8-细胞前发育阶段蛋白质为胞质定位,桑椹胚之后则为核定位。CDX 2蛋白在囊胚阶段开始表达,并定位于囊胚的滋养外胚层胞质和细胞核中。(3)OCT4, NANOG和SOX2在体外发育孤雌胚胎中的表达情况类似于体内。但总体上,mRNA的表达水平低于体内发育胚胎;蛋白质表达也呈现发育时间的暂时性波动和胚胎空间位置上的变化。OCT4和NANOG蛋白自8-细胞到囊胚为核定位,而SOX2则从桑椹胚开始出现核定位。CDX2蛋白在孤雌囊胚的内细胞团细胞和滋养外胚层细胞中均有表达,并表现为核定位。

山羊早期胚胎发育过程中胚胎干细胞标记分子的表达检测

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