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猪伪狂犬超强毒株的分离鉴定及非编码短片段DNA文库的构建

作　者: 潘霄
导　师: 李学伍
学　校: 河南科技大学
专　业: 兽医
关键词: 猪伪狂犬病毒分离鉴定非编码区
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 56次
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内容摘要

从河南林州某猪场大批死亡仔猪的脾、肾及脑组织当中分离到一株疑似猪伪狂犬病毒（PRV）的毒株，该毒株经细胞连续传代培养后，接种PK-15细胞能够出现明显的细胞病变，与PRV阳性血清进行微量中和试验，结果证明该病毒毒株能够被阳性血清中和，通过对该病毒半数细胞感染量（TCID50）的测定得出结果TCID50=10-5.3/0.1ml。病毒对氯仿、乙醚敏感，56℃水浴30min能使其灭活。将所分离的病毒分别接种于小白鼠和家兔，数天后均表现有明显的伪狂犬病临床症状。根据GeneBank当中所显示的猪伪狂犬病毒gp50基因的保守序列设计引物，利用酶链聚合反应（PCR）技术扩增出gp50基因片段，将扩增产物进行切胶回收，纯化克隆后送去测序公司进行测序，利用DNA Star软件将测序结果与其它经典猪伪狂犬毒株进行序列比对分析，同源性达到99%，结果证实所分离病毒为猪伪狂犬病毒。该分离病毒的某些生物学特性有待进一步分析与研究。本研究参照GanBank中（序列号：JF797219）的典型PRV毒株基因组完整序列，在非编码区域利用Primer Premier5软件设计出多对特异性引物。通过PCR条件优化筛选出合理的扩增方法，利用PCR技术分段扩增出猪伪狂犬病毒非编码区短片段DNA，获得大小不同的非编码区DNA短片段基因，将扩增的产物DNA片段经纯化、克隆与载体相连接，并通过对阳性菌进行PCR扩增及核苷酸序列的测序分析，成功构建出非编码区DNA文库。本研究通过细胞培养和分离鉴定获得了PRV毒株，即PRV Linzhou株（暂定名），为PRV的毒力演变和分子生物学的研究奠定了基础，同时构建了该毒株基因组非编码区DNA文库，为PRV非编码区对病毒复制和潜伏感染调控功能的研究提供了研究素材。

全文目录

摘要  2-3
ABSTRACT  3-7
第1章文献综述  7-15
  1.1 伪狂犬病简介  7-11
    1.1.1 伪狂犬病的临床特征  7-8
    1.1.2 伪狂犬病的流行病学  8-9
    1.1.3 猪伪狂犬病的病原特性  9-11
  1.2 猪伪狂犬病毒的分子生物学  11
  1.3 猪伪狂犬病检测方法的研究进展  11-13
  1.4 猪伪狂犬基因组研究进展  13-14
  1.5 本研究的目的和意义  14-15
第2章河南猪伪狂犬病毒的分离与鉴定  15-28
  2.1 试验材料与仪器  15-17
    2.1.1 主要试验材料  15
    2.1.2 主要仪器设备  15-16
    2.1.3 主要培养基的配制  16-17
    2.1.4 主要试剂的配制  17
  2.2 试验方法  17-21
    2.2.1 病料处理  17-18
    2.2.2 病毒的培养  18-21
  2.3 结果与分析  21-27
    2.3.1 病毒的细胞培养  21-22
    2.3.2 病毒 TCID50 测定  22-23
    2.3.3 动物感染试验  23
    2.3.4 理化特性检验  23-24
    2.3.5 微量中和试验  24
    2.3.6 病毒 PCR 鉴定结果  24
    2.3.7 病毒 DNA 片段的克隆与序列分析  24-27
  2.4 讨论  27-28
第3章猪伪狂犬病毒非编码区短片段 DNA 文库的构建  28-42
  3.1 试验材料与方法  28-30
    3.1.1 试验材料  28
    3.1.2 菌株和质粒  28
    3.1.3 病毒和细胞  28
    3.1.4 试验仪器和设备  28-29
    3.1.5 主要培养基的配置  29-30
  3.2 试验方法  30-34
    3.2.1 病毒 DNA 的提取  30
    3.2.2 扩增 UTR 的引物设计与合成  30-32
    3.2.3 PCR 试验  32
    3.2.4 目的片段的回收与纯化  32-33
    3.2.5 目的产物与载体相接  33
    3.2.6 感受态细胞的制备(CaCl2)  33
    3.2.7 转化  33
    3.2.8 鉴定转化结果  33-34
  3.3 结果与分析  34-41
    3.3.1 病毒 PCR 扩增反应  34-38
    3.3.2 病毒 DNA 片段的克隆与序列分析  38-41
  3.4 讨论  41-42
第4章结论  42-43
参考文献  43-47
致谢  47-48
攻读硕士学位期间的研究成果  48

猪伪狂犬超强毒株的分离鉴定及非编码短片段DNA文库的构建

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