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猪繁殖与呼吸综合征病毒3’非编码区结构与功能解析

作　者: 刘萍
导　师: 袁世山；姚火春
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 3’非编码区 茎环结构 凸起结构
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是一种可以引起以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统症状为特征的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病毒,对养猪业危害严重。PRRSV的基因组为一条长约15kb的单股正链RNA,包括5’端帽结构、5’非编码区、10个开放阅读框、3’非编码区(3’UTR)和3’ Poly (A)。该病毒有两个基因型：Ⅰ型(欧洲型)和Ⅱ型(北美型)。关于PRRSV病毒基因组RNA的复制、亚基因组mRNA的合成和蛋白的翻译、病毒颗粒组装以及病毒致病机理等许多问题目前尚未解决。大量研究已经证明,单股正链RNA病毒的3’非编码区(3’UTR)对病毒复制具有至关重要的作用,但是目前对于PRRSV的3’UTR的调控功能还知之甚少。本研究旨在采用反向遗传学(RGS)技术,利用实验室构建的Ⅱ型PRRSV全长感染性克隆,构建一系列3’UTR突变体,通过一系列在细胞水平上的体外试验,解析PRRSV 3’ UTR的结构与功能的关系,为进一步剖析病毒致病机理和人工控制病毒奠定基础。现将研究内容简述如下：1. PRRSV 3’ UTR 5’端序列缺失对病毒复制的影响在Ⅱ型PRRSV全长感染性克隆pAPRRS的基础上,利用突变PCR技术成功构建病毒基因组3’UTR系列缺失的全长突变质粒,将这些突变体转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和RT-PCR的方法分别鉴定缺失区域对蛋白翻译、亚基因组及负链基因组合成的影响。随后用转染上清感染MARC-145细胞,通过观察细胞病变检测上清中是否含有具有感染性的病毒,并通过空斑形态、生长曲线鉴定缺失区域对病毒在MARC-145细胞上复制效率的影响,以及通过RT-PCR检测拯救病毒基因组序列变化。结果显示病毒3’UTR 5’端前66个碱基是病毒感染性非必需的,但是缺失会降低病毒在MARC-145细胞上的复制效率；缺失67个碱基的突变体会降低亚基因组的合成丰度,并且不能拯救病毒；缺失67个碱基以上的突变体无拯救病毒产生同时也检测不到亚基因组,证明多于66个碱基的缺失会影响病毒感染性和亚基因组合成。本研究表明：Ⅱ型PRRSV 3’ UTR 5’端最多可以耐受66nt的缺失。2. PRRSV 3’ UTR保守二级结构元件的功能解析单股正链RNA病毒3’UTR中保守的二级结构元件通常具有很重要的作用。在上述非必需区以外,PRRSV 3’ UTR存在一个序列和结构都非常保守的带凸起的茎环结构,它包括1个茎环结构和1个“A-GC”凸起,推测这个结构在病毒复制中具有重要作用。为了研究这个元件序列和结构改变对病毒基因组的复制、亚基因组合成以及感染性的影响,本研究对Ⅱ型PRRSV全长感染性克隆3’UTR的茎环结构和“A-GC”凸起进行了一系列突变,然后将这些突变体转染BHK-21细胞,检测病毒蛋白翻译、亚基因组及负链基因组的合成,再用转染上清感染MARC-145细胞检测是否能产生感染性病毒以及拯救病毒的基因稳定性及病毒学上的特征。结果表明,病毒能耐受茎环结构中环的大小、茎环序列的改变,但这些变化会影响病毒在MARC-145细胞上的复制效率。茎环结构中茎部结构的稳定性对病毒亚基因组合成非常重要,破坏茎环结构中互补配对碱基会阻断病毒亚基因组合成。“A-GC”凸起是一个“A-VN”型凸起结构,可以耐受一定的碱基替换,但是任何引起该凸起结构变化的碱基突变都会使病毒丧失感染性。本研究表明：Ⅱ型PRRSV 3’ UTR顶端的带凸起的茎环结构的结构而非序列对病毒的亚基因组合成和感染性至关重要,它可能参与RNA/蛋白的相互作用。综上所述,PRRSV 3’ UTR对病毒复制非常重要,其中存在调控病毒复制过程的顺式作用元件。本研究在Ⅱ型PRRSV全长感染性克隆pAPRRS的平台上,对PRRSV 3’ UTR的结构和功能做了初步解析,证明了：(1)Ⅱ型PRRSV 3’ UTR的5’端前66个碱基是病毒复制非必需的；(2)在复制非必需区以外,PRRSV 3’ UTR存在一个保守的带凸起的茎环结构,它的结构而非序列对病毒亚基因组合成和感染性具有至关重要的作用。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
符号说明  12-13
第一篇 文献综述  13-37
  第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展  13-27
    1 病毒组成及分型  13-14
    2 病毒基因组结构  14
    3 病毒基因组编码的非结构蛋白  14-15
    4 病毒基因组编码的结构蛋白  15-17
    5 病毒的复制  17-19
    6 PRRSV与免疫  19-20
    7 小结  20-21
    参考文献  21-27
  第二章 单股正链RNA病毒3'UTR结构与功能研究进展  27-37
    1 3’UTR常见结构元件  28
    2 3’UTR结构与功能研究方法  28-30
      2.1 计算机方法预测RNA结构  28-29
      2.2 试验法测定RNA结构  29-30
    3 3’UTR的功能及其与结构的关系  30-33
      3.1 3’UTR调控病毒RNA合成  30-31
      3.2 3’UTR调控病毒翻译  31-32
      3.3 3’UTR影响病毒的细胞致病变性及致病力  32
      3.4 3’UTR其它生物学功能  32-33
    4 问题与小结  33-34
    参考文献  34-37
第二篇 试验研究  37-85
  第三章 PRRSV 3’UTR 5'端序列缺失对病毒复制的影响  37-57
    1 材料和方法  39-49
      1.1 质粒和细胞  39
      1.2 试剂  39
      1.3 主要仪器  39
      1.4 PRRSV 3’UTR缺失突变克隆的构建  39-44
        1.4.1 引物设计  39-40
        1.4.2 SOE-PCR(重叠延伸基因扩增技术)  40-42
        1.4.3 Xba Ⅰ、XhoⅠ双酶切反应  42-43
        1.4.4 连接反应  43
        1.4.5 抽提质粒和鉴定  43-44
      1.5 QIAgen试剂盒抽提转染所用质粒  44
      1.6 BHK-21细胞转染  44
      1.7 间接免疫荧光试验(IFA)  44-45
      1.8 基因组及负链基因组检测  45-47
        1.8.1 细胞总RNA的提取  45
        1.8.2 RT-PCR检测亚基因组  45-46
        1.8.3 RT-PCR检测负链基因组  46-47
      1.9 转染上清盲传  47
      1.10 突变病毒的鉴定  47-49
        1.10.1 突变病毒上清的传代  47
        1.10.2 病毒RNA的提取  47-48
        1.10.3 RT-PCR检测病毒基因组  48-49
      1.11 病毒生长特性研究  49
        1.11.1 病毒空斑形态分析  49
        1.11.2 病毒多步生长曲线的绘制  49
      1.12 APRRS和突变体3’UTR-二级结构预测分析  49
    2 结果  49-54
      2.1 Ⅱ型PRRSV全长3’UTR 5'端缺失突变质粒构建结果  49-50
      2.2 间接免疫荧光结果  50-51
      2.3 基因组及负链基因组检测结果  51-52
      2.4 突变病毒的拯救和突变病毒基因组鉴定  52
      2.5 突变病毒生长特性分析  52-53
        2.5.1 空斑形态比较  52-53
        2.5.2 多步生长曲线的绘制  53
      2.6 突变体二级结构分析  53-54
    3 讨论  54-56
    参考文献  56-57
  第四章 PRRSV 3’UTR保守二级结构元件的功能解析  57-85
    1 材料与方法  58-69
      1.1 质粒和细胞  59
      1.2 试剂  59
      1.3 主要仪器  59-60
      1.4 PRRSV 3’UTR序列和结构分析  60
      1.5 中间质粒pB3’UTR的构建  60-61
        1.5.1 Xba Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切  60-61
        1.5.2 连接反应  61
        1.5.3 抽提质粒和鉴定  61
      1.6 茎环结构突变质粒的构建  61-64
        1.6.1 引物设计  61-62
        1.6.2 点突变PCR  62-63
        1.6.3 消化DNA模板  63
        1.6.4 抽提质粒和鉴定  63
        1.6.5 双酶切  63-64
        1.6.6 连接反应  64
        1.6.7 抽提质粒和鉴定  64
        1.6.8 突变体结构分析  64
      1.7 "A-CG"凸起结构(bulge"A-GC")突变质粒的构建  64-67
        1.7.1 引物设计  64-65
        1.7.2 点突变PCR  65
        1.7.3 消化DNA模板  65-66
        1.7.4 抽提质粒和鉴定  66
        1.7.5 双酶切  66
        1.7.6 连接反应  66
        1.7.7 抽提质粒和鉴定  66
        1.7.8 突变体结构分析  66-67
      1.8 BHK-21细胞转染  67
      1.9 间接免疫荧光试验(IFA)  67
      1.10 亚基因组及负链基因组检测  67-68
        1.10.1 细胞总RNA的提取  67
        1.10.2 RT-PCR检测亚基因组  67-68
        1.10.3 RT-PCR检测负链基因组  68
      1.11 转染上清盲传  68
      1.12 突变病毒的鉴定  68-69
        1.12.1 突变病毒上清的传代  68
        1.12.2 病毒RNA提取  68
        1.12.3 RT-PCR检测病毒基因组  68-69
      1.13 病毒生长特性研究  69
        1.13.1 病毒空斑形态分析  69
        1.13.2 病毒多步生长曲线的绘制  69
    2 结果  69-81
      2.1 序列和结构分析结果  69-71
      2.2 茎环结构突变克隆的鉴定及结构分析  71-72
      2.3 "A-GC"凸起结构突变克隆的鉴定及结构分析  72-74
      2.4 间接免疫荧光结果  74-75
      2.5 基因组及负链基因组检测结果  75-76
      2.6 突变病毒的拯救和突变病毒的基因组鉴定  76-78
      2.7 突变病毒生长特性分析  78-81
        2.7.1 空斑形态比较  78-79
        2.7.2 多步生长曲线的绘制  79-81
    3 讨论  81-83
    参考文献  83-85
全文总结  85-87
致谢  87

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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