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CK/SH/F/98株H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备和CK/SD/C9/11株生物学特性及表面基因序列分析

作　者: 李烨初
导　师: 石火英
学　校: 扬州大学
专　业: 基础兽医学
关键词: H9N2亚型 禽流感病毒 单克隆抗体 传播特性 序列分析
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 43次
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内容摘要


H9N2亚型禽流感病毒在我国广泛流行和传播,给我国的养禽业造成了严重的经济损失。1999年首次出现H9N2亚型禽流感病毒感染人的报道。最近在我国部分省市出现了H7N9亚型禽流感病毒感染人并造成死亡的报道,该病毒可能是通过基因重排产生的新亚型禽流感病毒,因此禽流感病毒已对人类的健康和生命安全产生巨大的威胁。本论文研制了H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体,分析了单抗的特异性,并利用研制的单抗,通过免疫组织化学方法检测了SPF鸡感染H9N2亚型禽流感病毒后抗原在组织中的分布情况；本论文还探讨了新分离的一株H9N2亚型禽流感病毒的传播和复制特性,运用病理组织学和免疫组织化学方法对其进行了致病性方面的研究；同时对其HA基因和NA基因进行了序列测定和遗传进化分析。为H9N2亚型禽流感病毒的快速诊断、抗原性分析和流行病学调查提供了有价值的技术资料。以我国流行的代表株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2,简称F株)作为免疫原,通过差速离心法提纯后免疫8周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过HI试验和间接ELISA试验筛选出阳性细胞孔,并经三次有限稀释法克隆,获得了1C10、6D7两株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株细胞培养上清和腹水HI效价分别为27-8、213-14,腹水ELISA效价均达到了5×104以上；特异性实验表明两株细胞培养上清与H5亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合症病毒无任何交叉反应,仅与H9亚型禽流感病毒发生凝集抑制反应,具有良好的特异性；Western blotting分析显示两株单抗能与禽流感病毒75kd的蛋白发生特异性反应,表明了是针对H9亚型禽流感病毒HA蛋白的单抗；用F株尿囊液按107EID50接种剂量攻毒4周龄SPF鸡,第5天将其剖杀,通过免疫组织化学方法,利用所制备的单抗检测到鸡肺脏中的H9亚型AIV抗原的分布。选取在山东齐河县新分离得到的一株H9N2亚型禽流感病毒,命名为A/Chicken/Shandong/C9/2011,简称C9株,经测定C9株AIV的血凝效价为210-11,EID50和ELD50分别为1011.25/0.2mL、109/0.2mL,是很好的H9N2亚型禽流感病毒的疫苗候选株。但是该株的传播特性和复制特性还不清楚,因此本章对此进行了研究。将C9株AIV尿囊液按107EID50剂量通过口服、滴鼻和点眼的方法对4周龄SPF鸡进行传播特性和致病性实验。对4周龄SPF鸡的传播特性实验发现,C9株AIV主要在呼吸道复制,在消化系统也分离到病毒；可以通过直接接触、气溶胶传播途径和粪便接触途径传播。显微观察C9株感染鸡只后各组织的病理组织学变化,发现病变主要集中在气管和肺脏中,但消化系统未出现明显的病变；利用所制备的单抗在鸡气管和肺脏中检测到了C9株AIV抗原。为从分子水平上了解C9株AIV HA基因和NA基因的变异情况,本论文第三章参照Genbank上已发表的H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因核苷酸序列设计出特异性扩增引物,利用RT-PCR的方法扩增出HA基因和NA基因,进行克隆和测序。通过对C9株AIVHA基因和NA基因的核苷酸同源性序列分析和遗传进化分析,结果表明了C9株AIVHA基因和NA基因都来自于Y280-like亚系,与其代表株A/Duck/Hongkong/Y280/97(H9N2)核苷酸同源性分别为92.8%、93.6%；进一步推导发现,C9株AIV与A/Duck/Hongkong/Y280/97(H9N2)的HA基因和NA基因的氨基酸同源性分别达到了94.4%和95.3%,亲缘关系较近；但与人源流感病毒A/HK/1073/99(H9N2)的HA基因和NA基因的核苷酸同源性分别为88.4%和89.7%。本研究中的C9株AIV HA基因裂解位点为R-S-S-R,是典型的低致病性H9亚型禽流感；在第218位缺失了一个潜在糖基化位点；在第190位的氨基酸突变为丙氨酸(Ala)；在第226位的氨基酸由谷氨酸(Gln)突变为亮氨酸(Leu),具备与人细胞受体结合的分子基础。而C9株AIV NA基因在63-65位缺失3个特征性的氨基酸,导致了1个糖基化位点缺失,其余糖基化位点均高度保守,红细胞吸附位点在第369位氨基酸由天冬氨酸(Asp)变成了天冬酰胺(Asn)。表明C9株的某些氨基酸发生了改变,但是否直接影响了C9株的传播性和致病性,还有待进一步研究。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
符号说明  11-14
第一部分 文献综述  14-27
  1 H9N2亚型禽流感病毒的分子病原学特征  14-15
  2 H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化  15
  3 H9N2亚型禽流感病毒的变异特性  15-16
  4 H9N2亚型禽流感的流行特点  16-17
  5 H9N2亚型禽流感的疫苗研究  17-18
  6 H9N2亚型禽流感病毒的诊断技术  18
  7 H9N2亚型禽流感病毒对人类的潜在威胁  18-19
  8 结论  19-20
  参考文献  20-27
第二部分 实验内容  27-75
  第一章 H9N2亚型禽流感病毒的单克隆抗体制备  27-43
    1 材料  27-30
      1.1 病毒株  27
      1.2 SPF鸡胚、试验动物、细胞系  27-28
      1.3 主要试剂  28
      1.4 主要试剂的配制  28-30
        1.4.1 细胞培养相关试剂的配制  28
        1.4.2 ELISA实验相关试剂的配制  28-29
        1.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相关试剂的配制  29
        1.4.4 Western blotting相关试剂的配制  29-30
      1.5 主要设备仪器及耗材  30
    2 方法  30-36
      2.1 抗原的制备  30-31
        2.1.1 病毒增殖  30
        2.1.2 病毒灭活  30-31
        2.1.3 病毒纯化  31
      2.2 动物免疫  31
      2.3 杂交瘤细胞株的建立与筛选  31-34
        2.3.1 饲养细胞的制备  31-32
        2.3.2 SP2/0细胞的制备  32
        2.3.3 脾细胞的制备  32
        2.3.4 细胞融合  32-33
        2.3.5 抗原最适包被浓度的确定  33
        2.3.6 杂交瘤细胞上清的检测  33
        2.3.7 杂交瘤细胞的克隆化  33-34
        2.3.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏  34
      2.4 单克隆抗体腹水的制备及抗体效价的测定  34
      2.5 单克隆抗体的特异性鉴定  34-35
      2.6 单克隆抗体鸡胚半数保护量的测定  35
      2.7 单克隆抗体的Western blotting鉴定  35
      2.8 病毒抗原的免疫组织化学检测  35-36
        2.8.1 攻毒实验  35
        2.8.2 免疫组织化学实验  35-36
    3 结果  36-39
      3.1 抗原的制备  36
      3.2 细胞融合  36
      3.3 抗原最适包被浓度的确定  36-37
      3.4 杂交瘤细胞株的建立与筛选  37
      3.5 单克隆抗体的细胞培养上清效价和腹水效价  37
      3.6 单克隆抗体的特异性鉴定  37
      3.7 单克隆抗体鸡胚半数保护量的测定  37-38
      3.8 Western blotting结果  38
      3.9 病毒抗原的免疫组织化学检测结果  38-39
    4 讨论  39-41
    5 结论  41-42
    参考文献  42-43
  第二章 H9N2亚型禽流感病毒的传播特性研究  43-57
    1 材料  43-44
      1.1 病毒株  43
      1.2 试验动物  43
      1.3 SPF鸡红细胞、H9N2亚型单克隆抗体、H9亚型禽流感阳性血清  43
      1.4 主要试剂  43-44
      1.5 主要试剂的配制  44
      1.6 主要设备仪器  44
    2 方法  44-48
      2.1 毒株纯化  44-45
      2.2 病毒增殖和鸡胚死亡平均时间(MDT)的测定  45
      2.3 H9N2亚型油乳剂疫苗制备与阳性血清的制备  45
      2.4 清学试验  45
      2.5 病毒血凝素热稳定性的测定  45-46
      2.6 鸡胚半数感染量和鸡胚半数死亡量的测定  46
      2.7 传播性试验  46-47
        2.7.1 动物试验分组  46
        2.7.2 分组布置  46
        2.7.3 病毒接种  46
        2.7.4 样品采集及检测  46-47
      2.8 致病性实验  47-48
        2.8.1 动物实验分组  47
        2.8.2 临床症状及剖检病变  47
        2.8.3 病料的采集与处理  47
        2.8.4 石蜡切片制作  47-48
        2.8.5 免疫组织化学实验  48
    3 结果  48-54
      3.1 血清学试验结果  48
      3.2 H9N2亚型油乳剂疫苗与阳性血清的检测结果  48
      3.3 鸡胚平均死亡时间测定试验结果  48
      3.4 病毒血凝素热稳定性试验测定结果  48-49
      3.5 鸡胚半数感染量和鸡胚半数死亡量的试验测定结果  49-50
      3.6 传播性试验结果  50-51
      3.7 致病性试验结果  51-54
        3.7.1 临床症状及剖检病变  51-52
        3.7.2 病理组织学变化结果  52-53
        3.7.3 免疫组化染色结果  53-54
    4 讨论  54-55
    5 结论  55-56
    参考文献  56-57
  第三章 H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因的序列分析  57-75
    1 材料  57-58
      1.1 病毒株  57
      1.2 SPF鸡胚  57
      1.3 H9亚型禽流感阳性血清  57
      1.4 主要试剂  57-58
      1.5 主要试剂配制  58
      1.6 主要设备仪器及分子生物学分析软件  58
    2 方法  58-64
      2.1 病毒复苏与增殖  58
      2.2 引物的设计和合成  58-59
        2.2.1 反转录(RT)引物设计  58
        2.2.2 HA基因和NA基因的RT-PCR引物设计  58-59
      2.3 病毒总RNA的提取  59
      2.4 病毒基因组的反转录(RT)反应  59-60
      2.5 HA基因的扩增  60
      2.6 NA基因的扩增  60-61
      2.7 HA基因和NA基因的测序  61-62
        2.7.1 PCR产物的回收  61
        2.7.2 感受态细胞的制备  61
        2.7.3 PCR产物的连接  61-62
        2.7.4 质粒转化  62
        2.7.5 质粒提取  62
        2.7.6 酶切鉴定  62
        2.7.7 HA基因和NA基因的序列测定  62
      2.8 HA基因和NA基因序列比较分析及进化树的绘制  62-64
    3 结果  64-70
      3.1 RT-PCR扩增结果及测序结果  64-65
      3.2 HA基因和NA基因核苷酸同源性比较  65-66
      3.3 HA基因和NA基因的遗传进化树  66-67
      3.4 HA基因的关键位点氨基酸的分析  67-69
      3.5 NA基因的关键位点氨基酸分析  69-70
    4 讨论  70-72
    5 结论  72-73
    参考文献  73-75
致谢  75-76
发表论文  76-77

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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