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鸡IL-18的原核表达及其对鸡免疫功能的影响

作　者: 刘栋
导　师: 陈书明
学　校: 山西农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鸡 ChIL-18 原核表达 免疫佐剂
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


[目的]克隆鸡白细胞介素18(ChIL-18)基因并在大肠杆菌BL21中进行表达；通过动物试验,研究表达产物ChIL-18对鸡免疫功能的影响,为ChIL-18的临床应用奠定基础。[方法]根据GenBank中已发表的ChIL-18基因序列,设计一对特异性引物;以鸡脾脏总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出ChIL-18基因。构建原核表达载体pET32a-ChIL-18并将其转化到大肠杆菌BL21中进行表达,将表达产物ChIL-18进行复性、纯化。对试验用鸡进行肾支灵免疫的同时肌注纯化的ChIL-18,然后定期测定雏鸡的各项免疫学指标。[结果](1)扩增出的ChIL-18基因为635bp,与GenBank中公布的ChIL-18基因比对,同源性为99%,氨基酸同源性分析表明同源性为100%,证实ChIL-18基因克隆成功。(2)双酶切及PCR鉴定表明,ChIL-18重组表达载体pET-32a-ChIL-18构建成功;SDS-PAGE分析表明,诱导表达蛋白约40kD,符合实验预期。(3)动物试验表明,重组ChIL-18能够使红细胞C3b受体花环率升高、红细胞IC花环率降低,提高雏鸡外周血液中活性T/B淋巴细胞百分率,促进雏鸡的生长发育,提高ND、NIB疫苗的抗体水平,并提高受NIBV攻击雏鸡的免疫保护率。[结论]原核表达的ChIL-18能够增强鸡的免疫功能,提高NIB和ND疫苗的免疫效果。

全文目录


摘要  8-9
文献综述  9-21
  1 IL-18系统组成、信号通路及生物学功能  9-13
    1.1 IL-18系统的组成  9-11
    1.2 IL-18信号通路  11-12
    1.3 IL-18的生物学功能  12-13
  2 鸡白介素18(ChIL-18)研究进展  13-16
  3 其他物种IL-18研究进展  16-19
  4 IL-18的应用前景  19-21
前言  21-22
实验一 鸡IL-18基因的克隆及序列分析  22-36
  1 材料  22-23
    1.1 实验动物  22
    1.2 菌株与载体  22
    1.3 主要试剂  22
    1.4 主要仪器  22-23
  2 方法  23-29
    2.1 鸡脾脏组织总RNA的提取  23-24
    2.2 总RNA的电泳检测  24
    2.3 引物设计与合成  24
    2.4 鸡IL-18基因的PCR扩增  24-25
    2.5 PCR产物的纯化回收  25-26
    2.6 鸡IL-18基因与pMD-18-T的连接  26
    2.7 pMD-18-T-ChIL-18的转化  26-27
    2.8 pMD-18-T-ChIL-18菌液的PCR鉴定  27
    2.9 pMD-18-T-ChIL-18质粒DNA的提取  27-28
    2.10 pMD-18-T-ChIL-18质粒的鉴定  28-29
  3 结果与分析  29-35
    3.1 鸡脾脏组织总RNA的提取结果  29-30
    3.2 鸡IL-18基因的PCR结果  30
    3.3 pMD-18-T-ChIL-18的阳性克隆鉴定  30-31
    3.4 pMD-18-T-ChIL-18菌液PCR鉴定  31
    3.5 pMD-18-T-ChIL-18质粒鉴定  31-35
  4 讨论  35-36
实验二 鸡IL-18基因原核表达载体的构建及其表达  36-47
  1 材料  36-37
    1.1 菌株与载体  36
    1.2 主要试剂  36
    1.3 主要仪器  36-37
  2 方法  37-42
    2.1 鸡IL-18基因原核表达载体的构建  37-39
    2.2 诱导表达  39
    2.3 表达产物的SDS-PAGE  39-40
    2.4 从包涵体中纯化表达蛋白  40-42
  3 结果与分析  42-46
    3.1 pET-32a的双酶切鉴定  42-43
    3.2 pET-32a-ChIL-18的鉴定  43-44
      3.2.1 pET-32a-ChIL-18的PCR鉴定  43-44
      3.2.2 pET-32a-ChIL-18的双酶切鉴定  44
    3.3 融合蛋白的表达及其纯化产物  44-46
      3.3.1 pET-32a-ChIL-18融合表达蛋白的SDS-PAGE  44-45
      3.3.2 pFJ-32a-ChIL-18融合表达蛋白纯化后的SDS-PAGE  45-46
  4 讨论  46-47
实验三 鸡IL-18原核表达蛋白对鸡免疫功能的影响  47-62
  1 材料  47-48
    1.1 主要材料  47
    1.2 主要试剂  47-48
  2 方法  48-50
    2.1 动物分组与处理  48-49
    2.2 红细胞C3b受体花环率及红细胞免疫复合物花环率的检测  49
    2.3 外周血液中活性T淋巴细胞百分率的测定  49
    2.4 外周血液中活性B淋巴细胞百分率的测定  49-50
    2.5 鸡脾脏系数的测定  50
    2.6 鸡肾传支抗体的测定--ELISA试验  50
    2.7 鸡新城疫抗体的测定--血凝抑制试验  50
    2.8 攻毒试验  50
    2.9 数据统计分析  50
  3 结果与分析  50-59
    3.1 临床观察  50
    3.2 原核表达蛋白ChIL-18对雏鸡红细胞免疫功能的影响  50-52
    3.3 原核表达蛋白ChIL-18对鸡外周血液中活性T淋巴细胞百分率的影响  52-53
    3.4 原核表达蛋白ChIL-18对鸡外周血液中活性B淋巴细胞百分率的影响  53-54
    3.5 原核表达蛋白ChIL-18对鸡脾脏系数的影响  54-55
    3.6 原核表达蛋白ChIL-18对鸡体重的影响  55-56
    3.7 原核表达蛋白ChIL-18对鸡肾传支抗体的影响  56-57
    3.8 原核表达蛋白ChIL-18对鸡新城疫HI抗体效价的影响  57-58
    3.9 原核表达蛋白ChIL-18对攻毒鸡只体重、免疫器官系数的影响  58
    3.10 原核表达蛋白ChIL-18对攻毒鸡只死亡率和免疫保护率的影响  58-59
  4 讨论  59-62
    4.1 原核表达蛋白ChIL-18对鸡免疫功能的影响  59-60
    4.2 原核表达蛋白ChIL-18对疫苗免疫效果的影响  60-62
结论  62-63
参考文献  63-69
附录  69-71
Abstract  71-73
致谢  73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜免疫学
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