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脂联素对肉鸡脂肪代谢调控及其分子机制研究

作　者: 闫峻
导　师: 孙超
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 肉鸡 脂联素 脂肪沉积 脂肪细胞 肉品质 线粒体 信号通路
分类号: S831
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本研究通过活体药物处理、构建超表达及干扰载体并处理鸡原代脂肪细胞、球状脂联素处理细胞等技术手段,研究脂联素对肉鸡活体脂肪沉积、肌肉品质和鸡脂肪细胞中脂代谢的影响及其调控机制。试验获得以下结果：1.为了研究肉鸡脂联素表达变化对活体脂肪沉积及肌肉品质的影响,试验采用罗格列酮及地塞米松处理肉鸡,连续处理三周,检测血清中脂联素水平,脂联素及其受体基因的表达规律,同时研究肉鸡体脂沉积,检测脂肪组织中脂代谢关键基因的表达。结果表明：(1)罗格列酮显著上调肉鸡血清中脂联素水平,地塞米松显著抑制血清中脂联索水平,并呈时间依赖性；(2)罗格列酮显著上调腹脂、皮脂、胸肌、腿肌和肝脏中脂联素及其受体AdipoR1基因的表达；(3)罗格列酮显著降低血清中TG和LDL-C水平,上调HDL-C水平,地塞米松显著上调血清中TG和LDL-C水平,下调HDL-C水平；(4)罗格列酮显著抑制腹脂和颈部皮脂以及胸肌和腿肌中的脂质沉积,而地塞米松显著增加肉鸡腹脂、腹部皮脂、颈部皮脂和腿部皮脂以及胸肌和腿肌中脂质沉积；(5)罗格列酮显著下调胸肌和腿肌中总FA、SFA和MUFA的含量,地塞米松则显著促进肌肉中脂肪酸的沉积；(6)罗格列酮处理组肌肉剪切力上升,滴水损失上升,肉色下降,而地塞米松组则相反。(7)罗格列酮显著上调脂肪、肝脏和胸肌中ATGL基因的表达,显著抑制脂肪及肝脏组织中CEBPα和FAS的表达。地塞米松显著上调CEBPα和FAS的表达,而显著抑制ATGL基因的表达。2.为了研究全长脂联素表达变化对鸡脂肪细胞分化的影响,试验构建了鸡脂联素基因超表达及干扰真核质粒载体,处理鸡原代脂肪细胞细胞。结果表明：(1)超表达脂联素抑制脂肪细胞分化及脂滴生成,而沉默脂联素基因则促进鸡脂肪细胞分化和脂滴生成；(2)超表达脂联素抑制了CEBPα和FAS的表达水平,而促进了ATGL的表达。干扰脂联素基因则促进了CEBPα和FAS的表达,抑制了ATGL的表达；(3)超表达脂联素激活了p38MAPK/ATF-2信号通路,SB253580能够阻断这种活化作用,而干扰脂联素则抑制了p38MAPK/ATF-2通路;(4)超表达脂联素抑制了TOR/p70S6Kinase信号通路,雷帕霉素则能够加强这种抑制作用,而干扰脂联素则激活了TOR/p70S6Kinase信号通路。3.为了研究全长脂联素的水解产物-球状脂联素对鸡脂肪细胞分化鸡脂质蓄积的影响,试验采用200μg/mL人重组球状脂联素处理鸡原代脂肪细胞。结果表明：(1)球状脂联素能够促进鸡脂肪细胞内源脂联素及AdipoR1基因表达；(2)球状脂联素抑制了鸡脂肪细胞分化和脂质沉积(3)球状脂联素上调CEBPα和FAS的表达,抑制了FAS表达；(4)球状脂联素上调p38MAPK/ATF-2蛋白磷酸化水平,并且能够修复SB253580介导的p38MAPK/ATF-2通路抑制作用；(5)球状脂联素抑制TOR/p70S6Kinase蛋白磷酸化水平,并且能够协同雷帕霉素进一步降低TOR/p70S6Kinase蛋白磷酸化。4.为了研究鸡脂联素对脂肪细胞中线粒体发育及功能的影响,我们构建了鸡脂联素腺病毒载体处理鸡原代脂肪细胞,并采用干扰真核载体处理细胞。结果表明：(1)超表达脂联素负调控鸡脂肪细胞分化和脂质沉积,超表达脂联素促进CEBPα、LPL和ATGL的表达,抑制FAS、A-FABP和ACC的表达；(2)超表达脂联素促进鸡脂肪细胞24h葡萄糖摄取和培养基中FFA的释放,而干扰脂联素则抑制脂肪细胞24h葡萄糖摄取和培养基中FFA的释放；(3)脂联素促进脂肪细胞中线粒体发育及线粒体内糖脂代谢功能基因的表达；(4)脂联素上调脂肪细胞线粒体膜电位；(5)超表达脂联素促进p38MAPK和ERK的磷酸化水平,抑制TOR蛋白磷酸化。综上所述,本研究证明了罗格列酮和地塞米松分别上调或下调肉鸡活体内脂联素的表达,并且脂联素表达的变化与肉鸡体脂沉积以及肌肉品质成负相关关系；超表达脂联素以及重组球状脂联素显著抑制了脂肪细胞分化,而干扰脂联素基因则显著促进脂肪细胞分化,p38MAPK和TOR通路参与脂联素对鸡脂肪细胞分化的调节；超表达脂联素促进了鸡脂肪细胞中线粒体的发育并激活线粒体中糖脂代谢功能,并且上调了线粒体膜电位；ERK和TOR信号通路参与了脂联素对线粒体功能的调节。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-14
前言  14-16
第一部分 文献综述  16-28
  第一章 文献综述  16-28
    1.1 脂联素概述  16-21
      1.1.1 脂肪组织的内分泌功能  16-17
      1.1.2 脂联素的发现  17
      1.1.3 脂联素的分子结构  17-19
      1.1.4 脂联素受体  19-20
      1.1.5 脂联素基因表达及调控  20
      1.1.6 脂联素受体基因的表达及调控  20-21
      1.1.7 脂联素对能量代谢和脂代谢的影响  21
    1.2 脂肪细胞分化研究进展  21-25
      1.2.1 前体脂肪细胞分化模型  21-23
      1.2.2 脂肪细胞分化中分子事件  23-24
      1.2.3 脂联素对于脂肪细胞分化的影响  24-25
    1.3 线粒体研究综述  25-28
      1.3.1 线粒体概括  25-26
      1.3.2 线粒体与脂类代谢  26
      1.3.3 脂联素与线粒体发育和功能  26-28
第二部分 试验研究  28-86
  第二章 脂联素对肉鸡体脂沉积的影响  28-41
    2.1 试验材料  28-29
      2.1.1 试验动物与饲养管理  28
      2.1.2 试验分组与处理  28-29
      2.1.3 基础日粮及营养水平  29
    2.2 试剂和主要仪器设备  29-30
      2.2.1 主要试剂  29-30
      2.2.2 主要仪器设备  30
    2.3 样品采集和测定  30-35
      2.3.1 屠宰和采样  30
      2.3.2 生产性能测定  30
      2.3.3 脂肪含量  30
      2.3.4 血清中脂联素及血脂含量测定  30-31
      2.3.5 Real-time PCR  31-33
        2.3.5.1 RNA抽提  31
        2.3.5.2 反转录  31
        2.3.5.3 引物及退火温度  31-32
        2.3.5.4 Real-time PCR反应体系  32-33
      2.3.6 Western Blot  33-35
        2.3.6.1 组织总蛋白的提取及含量测定  33
        2.3.6.2 BCA法蛋白定量  33
        2.3.6.3 蛋白质电泳  33-35
      2.3.7 数据统计分析  35
    2.4 结果  35-38
      2.4.1 罗格列酮和地塞米松对肉鸡生产性能的影响  35
      2.4.2 罗格列酮和地塞米松对肉鸡体内脂联素及其受体表达的影响  35-36
      2.4.3 罗格列酮和地塞米松对肉鸡血脂水平以及体脂沉积的影响  36-37
      2.4.4 罗格列酮和地塞米松对肉鸡组织中脂代谢相关基因表达的影响  37-38
    2.5. 讨论  38-40
    2.6 小结  40-41
  第三章 脂联素对肉鸡肌肉中脂肪沉积及肉品质的影响  41-51
    3.1 试验材料  41-42
      3.1.1 试验动物与饲养管理  41
      3.1.2 试验处理与分组  41
      3.1.3 基础日粮及营养水平  41-42
    3.2 试剂和主要仪器设备  42
      3.2.1 主要试剂  42
      3.2.2 主要仪器  42
    3.3 样品采集和测定  42-44
      3.3.1 屠宰和采样  42
      3.3.2 IMF含量测定  42
      3.3.3 血清中脂联素含量测定  42
      3.3.4 肌肉品质测定  42-43
        3.3.4.1 肌肉pH值  42
        3.3.4.2 肉色测定  42
        3.3.4.3 系水力  42
        3.3.4.4 剪切力  42-43
        3.3.4.5 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)  43
      3.3.5 肌肉脂肪酸(fatty acid,FA)组成  43
      3.3.6 Real-time PCR  43-44
      3.3.7 Western Blot  44
      3.3.8 数据统计分析  44
    3.4 结果  44-48
      3.4.1 血清脂联素水平、肌肉中脂联素及其受体基因的表达  44-45
      3.4.2 肉品质分析  45-46
      3.4.3 脂肪酸组成分析  46-47
      3.4.4 罗格列酮和地塞米松对肌肉中脂代谢相关因子表达的影响  47-48
    3.5 讨论  48-49
    3.6 小结  49-51
  第四章 全长脂联素对鸡脂肪细胞中脂沉积的调控机制  51-62
    4.1 试验材料  51-52
      4.1.1 样品、菌株、质粒  51
      4.1.2 主要试剂  51-52
      4.1.3 常用试剂配制  52
    4.2 试验方法  52-54
      4.2.1 small-interfering RNA(siRNA)设计  52
      4.2.2 鸡前体原代脂肪细胞的分离与培养  52-53
      4.2.3 pcDNA3.1-ADPN及pGPU6/GFP/Neo重组质粒转染  53
      4.2.4 细胞处理  53
      4.2.5 转染重组质粒细胞ADPN mRNA和蛋白的检测  53
      4.2.6 脂肪细胞油红0染色  53
      4.2.7 培养基中游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)和甘油释放  53-54
        4.2.7.1 培养基中FFA测定  53-54
        4.2.7.2 培养基中甘油测定  54
      4.2.8 Real-time PCR检测脂代谢标志基因表达  54
      4.2.9 Western blot检测脂代谢标志蛋白及信通路标志蛋白磷酸化水平  54
      4.2.10 数据统计及分析  54
    4.3 试验结果与分析  54-60
      4.3.1 脂联素超表达载体和干扰载体的转染效率检测  54-55
      4.3.2 超表达及干扰ADPN基因对鸡原代脂肪细胞中脂代谢的影响  55-57
      4.3.3 超表达及干扰ADPN基因对鸡脂肪细胞中脂代谢关键基因表达的影响  57-58
      4.3.4 超表达ADPN基因激活p38 MAPK/ATF-2信号通路  58-59
      4.3.5 超表达ADPN抑制TOR/p70 S6Kinase信号通路  59-60
    4.4 讨论  60-61
    4.5 小结  61-62
  第五章 重组球状脂联素通过p38 MAPK和TOR信号通路抑制鸡原代脂肪细胞脂质蓄积  62-72
    5.1 材料  62-63
      5.1.1 材料  62
      5.1.2 主要试剂  62
      5.1.3 主要仪器  62-63
    5.2 试验方法  63
      5.2.1 鸡前体脂肪细胞的分离培养  63
      5.2.2 试验设计  63
      5.2.3 油红O染色提取测胞内脂质蓄积  63
      5.2.4 培养基中FFA的释放  63
      5.2.5 实时定量检测脂代谢基因表达  63
      5.2.6 Western蛋白印迹检测脂代谢相关蛋白以及通路磷酸化水平  63
      5.2.7 数据分析  63
    5.3 结果与分析  63-69
      5.3.1 外源添加重组脂联素对鸡原代脂肪细胞内源脂联素及其受体表达的影响  63-64
      5.3.2 外源添加重组脂联素对鸡原代脂肪细胞脂质沉积的影响  64-65
      5.3.3 球状脂联素在鸡脂肪细胞中激活p38 MAPK/ATF-2信号通路  65-66
      5.3.4 球状脂联素在鸡脂肪细胞中抑制TOR/p70 S6Kinase信号通路  66-67
      5.3.5 球状脂联素与p38 MAPK通路对脂肪细胞分化的影响  67-68
      5.3.6 球状脂联素与TOR通路对脂肪细胞分化的影响  68-69
    5.4 讨论  69-70
    5.5 小结  70-72
  第六章 脂联素对鸡脂肪细胞分化及线粒体发育和功能调控机制  72-86
    6.1. 材料与方法  72-76
      6.1.1 试验材料  72-73
        6.1.1.1 试验动物、腺病毒、质粒  72
        6.1.1.2 主要试验试剂  72-73
        6.1.1.3 主要试验仪器  73
      6.1.2 试验方法  73-75
        6.1.2.1 主要溶液配制  73
        6.1.2.2 肉鸡原代脂肪细胞培养  73
        6.1.2.3 细胞处理  73
        6.1.2.4 细胞形态观察、油红O染色及Bodipy染色  73
        6.1.2.5 透射电镜观察线粒体数目  73-74
        6.1.2.6 JC-1染色检测线粒体膜通透性  74
        6.1.2.7 JC-1染色流式细胞术  74
        6.1.2.8 Cyt-c免疫荧光分析  74-75
        6.1.2.9 细胞总RNA提取及Realtime-PCR检测脂代谢及线粒体标志基因表达  75
        6.1.2.10 细胞总蛋白收取及Westernblot检测脂代谢、线粒体中标志蛋白和通路蛋白磷酸化水平  75
        6.1.2.11 葡萄糖摄取率及培养基中游离脂肪酸含量检测  75
      6.1.3 数据处理及分析  75-76
    6.2 试验结果  76-84
      6.2.1 超表达及干扰效率检测  76
      6.2.2 脂联素对脂肪细胞中脂代谢的影响  76-77
      6.2.3 脂联素对鸡原代脂肪细胞脂代谢基因表达的影响  77-78
      6.2.4 脂联素对鸡原代脂肪细胞葡萄糖摄取及脂解影响  78-79
      6.2.5 脂联素对鸡原代脂肪细胞线粒体发育的影响  79-80
      6.2.6 脂联素对鸡原代脂肪细胞中Cyt-C表达影响  80
      6.2.7 脂联素对线粒体中糖脂代谢相关标志基因及蛋白表达的影响  80-81
      6.2.8 脂联素对鸡脂肪细胞线粒体通透性的影响  81-83
      6.2.9 脂联素对鸡原代脂肪细胞中相关信号通路的影响  83-84
    6.3 讨论  84-85
    6.4 小结  85-86
结论与进一步研究计划  86-87
参考文献  87-94
缩略词  94-95
致谢  95-96
作者简介  96

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
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