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茶树根域真菌的季节多样性及病原拮抗和降解活性真菌初步研究

作　者: 胡雲飞
导　师: 黎星辉
学　校: 南京农业大学
专　业: 茶学
关键词: 茶树内生真菌多样性混合培养抗性降解
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

茶园土壤-根系-微生物三者密切联系且相互影响构成了茶树根际环境,其作为茶树摄取营养的主要场所,根际环境中发生的变化对茶树的生长都起着重要作用。近些年来,植物内生真菌被人们广泛关注,继而成为目前国内外研究的热点之一。相对于其他植物内生真菌的研究情况,茶树内生真菌的研究起步较晚。本研究以无性系品种‘龙井长叶’茶树为材料,通过对真菌ITS区段进行鉴定,首次结合茶树根际土壤真菌和根系内生真菌,在不同季节下对其进行多样性分析,并研究内生真菌对真菌病原菌的拮抗作用及活性物质成分,同时对茶树修剪物降解的效果做了初步分析。研究结果如下：1.从不同季节的茶树根系和根际土壤中分离得到真菌2019株,包括茶树根系内生真菌826株、根际土壤真菌1193株。对rDNA-ITS区段进行扩增及分析,共鉴定出15个属28种真菌,其中茶树根系内生真菌12种,根际土壤真菌20种,对应的ITS1-5.8s-ITS2区段序列见附录；其中丛梗孢科Moniliaceae最为丰富。春、夏、秋季分离出茶树根系内生真菌种类分别为12、11、12；3个季节Shannon-Wiener多样性指数差异不明显；而均匀度指数夏季最高,秋季次之,春季最低；春、夏、秋季分离出根际土壤真菌种类分别为18、17、20；3个季节Shannon-Wiener多样性指数及均匀度指数差异不明显。根际土壤真菌与根系内生真菌比较,春、秋两季Shannon-Wiener多样性指数和均匀度指数差异明显且根际土壤真菌高于根系内生真菌；夏季两者差异均不明显。2.通过拮抗实验筛选出抗性内生真菌,得到柿假尾孢菌Pseudocercospora kaki和菌核青霉菌Penicillium sclerotiorum对稻瘟病病原菌Magnaporthe grisea具有拮抗作用,其中柿假尾孢菌Pseudocercospora kaki对稻瘟病病原菌的抑制率达到64.83%±1.45%。相对于单独培养,两菌混合培养对稻瘟病病原菌的抑制作用明显增强。不同时间段内混合培养原液对稻瘟病菌抑制率高达78.02%±2.19%；混合培养原液的乙酸乙酯萃取液对稻瘟病菌抑制率为62.81%±2.29%。GC-MS对两菌单独培养液和混合培养液的乙酸乙酯萃取液的成分进行分析,结果显示：混合培养萃取液中主要成分种类为11种,高于柿假尾孢菌单独培养萃取液的6种和菌核青霉菌单独培养萃取液的5种；且有4种成分相同,分别为丙三醇、4-羟基苯基乙醇、1,2,3,4-四羟基戊醛、1,2-苯二甲酸环己酯。3.茶树内生真菌对茶树修剪物的降解作用,通过两组处理方式：单独添加短密木霉Trichoderma brevicompactum (FG);添加短密木霉Trichoderma brevicompactum和发酵液(BF),分析对茶树修剪物降解作用。结果显示外施短密木霉能加速茶树修剪物褐化,具有降解作用；对纤维素的降解率相对于对照组具有明显差异,两组真菌处理FG和BF在最初10天内纤维素降解迅速,降解率分别为14.18%±0.28%和11.64%±0.74%。处理60天后纤维素含量分别为5.39%±0.43%和5.06%±0.18%,降解率达77.51%±0.43%和78.89%±0.18%；两组真菌处理对纤维素降解速率相似。对木质素的降解率相对于对照组具有明显差异,两组真菌处理FG和BF对木质素的降解促进作用较为明显,在30天到45天之间木质素的降解速率加快。在处理60天后木质素含量分别为8.80%±0.16%和8.49%±0.29%,降解率达62.10%±0.16%和63.44%±0.29%；两组真菌处理对木质素降解相似。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
英文缩写词汇表  11-12
第一章文献综述  12-26
  1 土壤真菌研究进展  12-16
    1.1 土壤真菌多样性  12-13
    1.2 真菌的分离与鉴定  13-14
    1.3 茶园土壤真菌生物组成及其变化  14-15
    1.4 茶园根际土壤真菌研究进展  15-16
  2 植物内生真菌研究现状  16-22
    2.1 内生真菌多样性  16-18
    2.2 内生真菌增强寄主植物生态适应性的表现  18-20
    2.3 茶树内生真菌研究概况  20-22
  3 真菌的综合利用  22-23
    3.1 次生代谢产物研究概况  22-23
    3.2 真菌的功能应用研究  23
  4 本研究的主要内容及意义  23-24
  5 本研究技术路线图  24-26
第二章茶树根系内生真菌与根际土壤真菌的季节多样性分析  26-42
  摘要  26-27
  1 实验材料  27-28
    1.1 茶树样本来源和采集方法  27
    1.2 培养基  27
    1.3 主要实验仪器、设备及药品  27-28
  2 实验方法  28-33
    2.1 根际土壤中真菌的分离与计数  28-29
    2.2 茶树根系内生真菌分离  29-30
    2.3 菌种的纯化、保藏和形态鉴定  30
    2.4 分子鉴定及系统发育树构建  30-33
    2.5 多样性分析方法  33
  3 结果与分析  33-40
    3.1 DNA提取与PCR反应结果  33-34
    3.2 凝胶回收与菌液检测  34-35
    3.3 真菌的分离与鉴定结果  35-38
    3.4 不同季节茶树根系内生真菌差异性分析  38
    3.5 不同季节根际土壤真菌差异性分析  38-40
    3.6 不同季节下茶园根系内生真菌和根际土壤真菌差异性分析  40
  4 讨论  40-42
第三章茶树内生真菌对病原真菌拮抗筛选及代谢成分分析  42-52
  摘要  42
  1 实验材料  42-43
    1.1 材料  42-43
    1.2 培养基  43
    1.3 主要实验仪器、设备及药品  43
  2 实验方法  43-45
    2.1 内生真菌之间相互关系  43
    2.2 培养原液的制备及抗菌活性的测定  43-44
    2.3 酸乙酯萃取液的制备及抗菌活性的测定  44
    2.4 洗脱液检测  44-45
    2.3 数据统计处理  45
  3 结果与分析  45-50
    3.1 柿假尾孢菌和菌核青霉菌混合培养  45-46
    3.2 不同时间不同培养原液对稻瘟病原菌的抑制作用  46-47
    3.3 不同培养液的乙酸乙酯萃取液对稻瘟病原菌的抑制作用  47-48
    3.4 硅胶薄层层析结果  48-49
    3.5 酸乙酯浓缩液的GC-MS成分分析  49-50
  4 讨论  50-52
第四章施加短密木霉菌Trichoderma brevicompactum对茶树修剪物降解作用  52-62
  摘要  52
  1 实验材料  52-53
    1.1 供试土壤  52-53
    1.2 供试材料  53
    1.3 溶液配制  53
    1.4 主要实验仪器、设备及药品  53
  2 实验方法  53-57
    2.1 菌体及发酵液配制  53
    2.2 盆栽土壤中修剪物和菌株施用  53-54
    2.3 修剪物纤维素和木质素测定方法  54-55
    2.4 土壤DNA的提取和18S rDNA的PCR扩增  55-56
    2.5 DGGE、染色及凝胶成像分析  56
    2.6 数据统计处理  56-57
  3 结果与分析  57-60
    3.1 不同处理下茶树修剪物变化差异  57
    3.2 不同处理茶树修剪物纤维素变化  57-58
    3.3 不同处理茶树修剪物木质素变化  58-59
    3.4 土壤DNA提取与18S rDNA基因的PCR-DGGE  59-60
  4 讨论  60-62
全文总结与展望  62-64
参考文献  64-74
攻读学位期间发表的论文  74-76
附录  76-86
致谢  86

茶树根域真菌的季节多样性及病原拮抗和降解活性真菌初步研究

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