学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

产皂苷的重楼内生真菌的分离、鉴定及退化研究

作　者: 魏超
导　师: 吴卫
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 重楼内生真菌分离培养基种类分离季节皂苷 ITS序列菌种退化
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 102次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

重楼,是百合科重楼属植物的泛称,其在云南和四川分布最为集中。《中华人民共和国药典》(2010年版)收录了滇重楼(Paris Polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz)和华重楼(Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara)两个变种。重楼以干燥根茎入药,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效。是“抗病毒冲剂”、“云南白药”和“宫血宁”的主要原料之一。重楼主要药用成分为甾体皂苷类物质,其具多种生理活性,有很高药用价值和开发潜力。重楼作为我国重要中成药的原料,需要量逐年增加,但由于其生长缓慢,繁殖系数低等,蕴藏量大大减少,已逐渐难以满足生产所需。近年来的研究表明,许多植物的内生真菌可以产生与寄主药用植物相同的药用成分。本试验以采自重楼资源比较丰富的四川天全的野生华重楼为材料,分离了其不同生长发育阶段内生真菌,对能产生皂苷的内生真菌进行了鉴定及其皂苷产量的分析,并开展了其产皂苷能力退化的初步研究,以期为进一步开发利用重楼资源,采用微生物发酵生产重楼药用成分,解决重楼资源短缺奠定基础,提供科学依据。主要研究结果如下：(1)在华重楼3个不同生长阶段分别采取3种不同培养基进行其内生真菌的分离,结果共分离得到15种不同真菌。其中8种在3个生长阶段均分离到。试验还发现,同种培养基在不同季节分离真菌的平均数差异较大,3-4月和12月-次年1月分离的平均菌落数和分离总类数高于7-8月间的平均菌落数和分离总类数,且以MPDA培养基分离效果相对较好。(2)将8种在三个生长阶段均分离的华重楼内生真菌(编号分别为WD7H、Cp、A221H、WD9H、A4H、XIA2X、WD6H、W2.1H)进行显微鉴定,初步鉴定分别为镰孢菌属、水霉目、球科目、毛霉目、曲霉属、曲霉属、镰刀菌属和隔孢纲目真菌。(3)采用发泡性试验以及薄层层析(TLC)方法对这8种内生真菌的发酵产物进行检测,确定有4种真菌(WD6H、WD7H、XIA2X和A221H)次生代谢产物中有重楼皂苷成分。进一步采用紫外分光光度法对其产皂苷元进行定量检测,发现其发酵液中的皂苷元产率分别为3.61mg/L、2.72mg/L、3.36mg/L和1.98mg/L。(4)采用真菌保守序列ITS序列对4种产皂苷的真菌进行分子鉴定,认为WD6H为腐皮孢霉菌(Fusarium solani)、WD7H为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、XIA2X为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、A221H为大团囊菌科红曲霉(Monascus fumeus)。(5)对能产生皂苷的WD6H、A221H进行菌种退化试验研究。结果发现,WD6H第1代菌丝可产皂苷0.68mg/mL,第5代菌丝仅产皂苷0.012mg/mL;A221H第1代菌丝可产皂苷0.49mg/mL,第5代菌丝仅产皂苷0.076mg/mLo即经过体外培养若干代后,重楼内生真菌产皂苷能力逐渐退化,如何保证重楼内生真菌产皂苷成分的能力稳定遗传,将成为下一步研究重点。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩略语  8-11
1 文献综述  11-22
  1.1 重楼的研究现状  11-16
    1.1.1 形态特征  11
    1.1.2 生长习性  11-12
    1.1.3 重楼的资源评价  12-13
    1.1.4 重楼的繁殖  13-15
    1.1.5 主要化学成分  15-16
  1.2 华重楼研究现状  16-18
    1.2.1 生长习性  16-17
    1.2.2 华重楼的成分和药理作用  17
    1.2.3 资源评价  17
    1.2.4 鉴定方法  17-18
  1.3 植物内生菌研究现状  18-21
    1.3.1 植物内生菌定义  18-19
    1.3.2 内生菌与植物的相互作用  19-20
    1.3.3 植物内生真菌的鉴定  20
    1.3.4 药用植物内生菌研究进展  20-21
  1.4 重楼内生真菌研究的前景及其展望  21-22
2 立题依据  22-23
3 材料和方法  23-31
  3.1 供试植物材料  23
  3.2 培养基制备  23
  3.3 内生真菌的分离及菌种纯化  23-24
    3.3.1 内生真菌的分离  23-24
    3.3.2 内生真菌分离的试验设计  24
    3.3.3 内生真菌的菌种纯化  24
  3.4 重楼内生真菌甾体皂苷的提取和检测  24-26
    3.4.1 发酵培养  24
    3.4.2 甾体皂苷的提取  24-25
    3.4.3 甾体皂苷的初步鉴定  25
    3.4.4 发酵液提取物的TLC检测  25-26
    3.4.5 内生真菌皂苷含量测定  26
  3.5 重楼的植物组织培养  26-27
    3.5.1 外植体的的诱导  26-27
    3.5.2 植物表面灭菌  27
  3.6 重楼内生真菌的菌种鉴定  27-31
    3.6.1 菌种的形态学鉴定  27
    3.6.2 菌种的显微观察  27
    3.6.3 内生真菌的ITS的序列分析  27-31
4 结果与分析  31-44
  4.1 菌种分离  31-34
    4.1.1 真菌分离季节与培养基类型对真菌分离的结果影响  31-33
    4.1.2 真菌在不同季节不同培养基中的种类分布  33-34
  4.2 重楼植物组织培养  34-35
  4.3 内生真菌的生物学性状观察  35-36
  4.4 内生真菌次生代谢产物皂苷的定性检测  36-39
  4.5 重楼内生真菌发酵产皂苷元的定量检测  39-40
    4.5.1 标准曲线的测定  39
    4.5.2 精密度试验  39
    4.5.3 重复性试验  39
    4.5.4 样品测定  39-40
  4.6 产甾体皂苷的内生真菌的分子生物学鉴定  40-43
    4.6.1 真菌DNA提取和ITS序列扩增情况  40-41
    4.6.2 内生真菌的测序结果  41
    4.6.3 ITS序列分子系统发育树  41-43
  4.7 WD6H、A221H产皂苷退化性研究  43-44
5 讨论  44-49
  5.1 重楼内生真菌的分离与季节的关系  44-45
  5.2 重楼内生真菌分离与培养基关系  45
  5.3 重楼内生真菌与植物寄生关系  45-46
  5.4 内生真菌的寄生与药用成分间关系  46-47
  5.5 内生真菌的成分分析  47
  5.6 内生真菌次退化的研究与内生菌资源的开发与利用  47-49
附录一八种内生真菌的菌落形态观察  49-52
附录二真菌的显微观察  52-55
参考文献  55-62
致谢  62

产皂苷的重楼内生真菌的分离、鉴定及退化研究

内容摘要

全文目录

相似论文