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普通小麦（Triticum aestivum L.）MAPKs基因家族的生物信息学分析及TaMPK1基因克隆与表达研究

作　者: 马占兵
导　师: 杨广笑
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦促分裂原活化蛋白激酶基因克隆表达分析
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

植物生命周期内要面临各种限制其生长、发育和生物质产率的环境胁迫因子。植物在长期的进化过程中形成了精细复杂的信号传导网络并赋予植物抗逆适应性。蛋白质可逆磷酸化作为分子开关参与胞内信号的快速、精确传递并发挥关键作用。蛋白激酶催化完成蛋白质磷酸化。促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信号系统广泛存在于真核细胞中，在进化上保守的信号通路模块，它通过调控基因表达和胞质功能而在植物对环境的主动适应过程中发挥关键作用。目前已知，MAPK级联信号系统最低程度上由MAPKKKs, MAPKKs, MAPKs三类蛋白激酶组成，并按照自上而下级联磷酸化的方式，将上游外源信号级联放大向下传递。小麦作为一种重要的禾本科粮食作物，其抗逆研究受到格外关注，然而受其基因组复杂性及尚未完成精确测序限制，目前小麦中有关MAPKs基因及其功能的研究报道相对较少。本研究利用小麦EST数据库，采用基于EST的电子克隆方法，分析预测小麦MAPKs基因家族的组成，并对初步得到的MAPKs基因进行生物信息分析。此外，通过RT-PCR技术克隆获得了TaMPK1,TaMPK4和TaMPK8三个MAPK基因cDNA全长。进而选取与水稻OsMPK2、拟南芥AtMPK1处于同一进化分支的TaMPK1，对其核酸序列特征、蛋白质信息及表达模式进行了初步研究。主要研究结果如下：1)小麦MAPKs基因家族生物信息分析利用水稻、拟南芥MAPKs基因和小麦EST数据库，电子克隆获得了11个小麦MAPKs基因；详细分析了它们的ORF、序列特征及亚细胞定位信息；利用Unigene数据库分析了这些基因电子表达谱；利用预测得到的小麦MAPKs与水稻、拟南芥、烟草和玉米MAPK的同源进化关系绘制系统进化树，归类并重新系统命名预测到的小麦MAPKs。2)小麦C组MAPK基因TaMPK1克隆及生物信息分析根据电子克隆，选择与拟南芥AtMPK1高同源的一Contig，设计特异引物从小麦幼苗总RNA反转录得到的cDNA模板中扩增到一特异性cDNA片段，该片段包含一个碱基数为1110bp的ORF，翻译含369个氨基酸，预测相对分子质量为42.2kD的蛋白质，命名为TaMPK1。序列分析显示，TaMPK1含有完整的11个植物MAPK保守的Ser/Thr蛋白激酶催化亚区，特别的是含一个TEY基序。系统进化分析显示其与水稻OsMPK2，拟南芥ATMPK1、ATMPK2、ATMPK7，烟草NtNTF3及豌豆PsMPK2具有较高同源性，分类上属于植物C组MAPK。3) TaMPK1亚细胞定位研究生物信息学预测及玉米同源基因TaMPK7亚细胞定位实验显示，TaMPK1定位于细胞核，但洋葱表皮细胞瞬时转化TaMPK1::GFP实验结果显示，绿色荧光呈细胞弥散性分布。4) TaMPK1特异性表达分析研究（1）通过实时荧光定量PCR技术检测TaMPK1基因在小麦不同组织中的表达模式结果显示，该基因在小麦根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、以及外稃中均有表达，但在茎中表达量最高。（2）通过低温、PEG、高盐处理小麦幼苗，模拟非生物性逆境胁迫，发现在4℃低温、20%PEG6000和200mmol/L NaCl处理下，TaMPK1基因的表达均上调，说明该基因广泛参与了小麦对低温、渗透胁迫和高盐等非生物逆境的响应。（3） ABA和过氧化氢两种信号分子处理小麦幼苗，研究其是否参与TaMPK1的表达调控。结果发现，该基因受H₂O₂和ABA诱导上调表达，表明H₂O₂和ABA信号通路可能参与了TaMPK1的表达调控。本研究获得的小麦基因组中有关MAPKs基因的信息，为在基因组水平上深入研究MAPKs基因的功能奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
英文缩写及中英文对照表  9-12
1 前言  12-29
  1.1 蛋白激酶概述  12-15
  1.2 植物MAPK级联信号途径组成  15-18
  1.3 植物MAPK级联信号转导通路作用概述  18-22
  1.4 小麦MAPKS研究现状  22-23
  1.5 生物信息学及电子克隆研究进展概述  23-26
  1.6 研究课题背景、主要目的、内容和技术路线  26-29
2 小麦MAPKs基因家族电子克隆  29-42
  2.1 研究方法与材料  29-32
  2.2 结果与分析  32-41
  2.3 本章小结  41-42
3 小麦TaMPK1 基因克隆与分析  42-51
  3.1 研究方法与材料  42-48
  3.2 结果与分析  48-50
  3.3 本章小结  50-51
4 小麦TaMPK1 基因生物信息学分析  51-70
  4.1 研究材料及方法  51-54
  4.2 结果与分析  54-69
  4.3 本章小结  69-70
5 小麦TaMPK1 基因表达分析  70-81
  5.1 研究材料及方法  70-73
  5.2 结果与分析  73-80
  5.3 本章小结  80-81
6 总结与展望  81-83
  6.1 总结  81
  6.2 展望  81-83
致谢  83-84
参考文献  84-89
附录 1 攻读硕士学位期间发表论文情况  89-90
附录 2 质粒图谱  90-91

普通小麦（Triticum aestivum L.）MAPKs基因家族的生物信息学分析及TaMPK1基因克隆与表达研究

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