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稻瘟病菌MoGNO1和MoHB1基因的表达特征及基因缺失突变体表型的初步分析

作　者: 陈一多
导　师: 孙国昌
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 一氧化氮 稻瘟病菌 S-亚硝基谷胱甘肽还原酶 黄素血红蛋白 荧光定量PCR 基因表达
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


一氧化氮(Nitric oxide, NO)是一种脂溶性的非极性自由基气体小分子,在胞内和胞间是一种重要的信号分子,在动植物和微生物的许多生理和病理过程中发挥着双向的调节作用。动植物中一氧化氮的作用机制已有了深入的研究,但在真菌内的报道还很有限。已有的研究显示NO参与调控真菌的产孢、孢子萌发、附着胞分化和细胞凋亡等生物学过程,然而关于其在真菌内的合成、去除和功能尚不清楚。研究表明稻瘟菌孢子萌发及附着胞分化过程中有NO的产生,且NO对稻瘟菌致病侵染结构的形成和致病性是必需的。在酿酒酵母(Saccharomvces cerevisia)中sfa1和yhb1基因参与了NO的代谢,通过同源检索,在稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中有它们的同源基因MoGNO1和MoHB1。为了进一步明确MoGNO1和MoHB1基因是否参与了NO代谢过程,以及它们在稻瘟菌发育和致病侵染过程中的作用,本研究拟克隆MoGNO1和MoHB1基因,分析它们在孢子萌发和附着胞分化过程中的表达特征,构建它们的基因缺失突变体并进行初步的表型分析。稻瘟病菌MoGNO1基因互补酵母sfa1突变体恢复了对甲醛的代谢能力,且MoGNO1重组蛋白的GSNO还原酶的活性达到了1002.1nmol NADH/mg/min;而MoHB1基因互补酵母yhbl突变体恢复了菌株抗GSNO胁迫的能力,表明MoGNO1和MoHB1分别与sfal和yhbl基因功能上同源。利用荧光定量PCR对MoGNO1和MoHB1基因在稻瘟菌孢子萌发及附着胞形成过程中的表达水平和时序进行分析,结果显示孢子萌发及附着胞分化过程中,MoGNO1表达量明显上调,MoHB1表达量先逐渐增加,在10hpi时达到峰值,而后又下降。这结果也暗示着MoGNO1和MoHB1基因可能与稻瘟菌孢子萌发及侵染结构的形成密切相关。构建了MoGNO1和MoHB1基因敲除载体,并对稻瘟病菌进行了转化,分别获得了72和52个转化子。经PCR和Southern杂交验证,各鉴定出两个敲除突变体。初步的生物学表型分析的结果显示,MoGNo1突变体的产孢量显著低于野生型Guy11,其对大麦和水稻叶片的致病性下降,而MoHB1突变体的产孢量和致病性与Guy11均没有差异；MoGNO1和MoHB1突变体的孢子萌发率、附着胞形成率比Guy11均有所下降,而附着胞塌陷率有所上升；它们在高渗透压和氧化胁迫下的营养生长与野生型相比均无显著差异。对MoGNO1突变体中MoHB1基因和MoHB1突变体中MoGNO1基因的表达进行分析,结果显示MoGNO1突变体中MOHB1的表达量总体呈下调趋势,而MoHB1突变体中MoGNO1的表达水平显著上调。但与野生型相比,它们在突变体中的表达特征发生了改变。处理10h后MoHB1基因在MoGNO1突变体中表达量最少,而MoGNO1基因在MoHB1突变体中也未体现逐渐升高的趋势。这或许说明MoGNO1和MoHB1基因间可能存在交互作用。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
缩略词  10-11
目录  11-13
第一部分 文献综述  13-24
  第一章 一氧化氮代谢平衡的研究现状  13-23
    第一节 一氧化氮在真菌内的代谢平衡  14-17
    第二节 一氧化氮代谢平衡在真菌中的研究进展  17-23
  第二章 本课题的研究目的与意义  23-24
第二部分 研究内容  24-61
  第一章 稻瘟病菌MoGNO1和MoHB1基因的克隆与表达分析  24-42
    1 材料与方法  24-28
    2 结果与分析  28-40
    3 讨论  40-42
  第二章 稻瘟病菌MoGNO1和MoHB1基因缺失突变体的获得和表型的初步分析  42-61
    1 材料与方法  42-46
    2 结果与分析  46-59
    3 讨论  59-61
参考文献  61-69
附录1 培养基及试剂配方  69-74
附录2 引物列表  74-77
附录3 Trizol法提取真菌RNA  77-78
附录4 PCR扩增和DNA克隆体系  78-80
附录5 CTAB法提取基因组DNA  80-81
附录6 农杆菌转化实验  81-82
附录7 稻瘟病菌ATMT转化  82-83
附录8 Southern杂交  83-86
附录9 酵母转化  86-87
攻读学位期间取得的研究成果  87-88
致谢  88-89

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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