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ZmCIPK8互作蛋白CBLs的筛洗

作　者: 申腾飞
导　师: 邰付菊
学　校: 河南农业大学
专　业: 植物学
关键词: ZmCIPK8 CBLs 酵母双杂交玉米亚细胞定位
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

CBL(calcineurin B-like proteins)是近年来发现的植物所特有的一类钙调磷酸酶B类蛋白，与其靶蛋白CIPK (CBL-interacting protein kinase)一起在植物应答胁迫信号转导过程中起重要作用。前期研究表明ZmCIPK8在玉米逆境胁迫响应中发挥着重要作用，探究它与CBLs的互作关系对于进一步研究ZmCIPK8响应逆境胁迫的分子机制具有重要意义。本研究采用生物信息学、酵母双杂交、RT-PCR及亚细胞定位等技术，初步筛选分析了可能与ZmCIPK8相互作用的的CBLs，主要结果如下：（1）通过与水稻和拟南芥中的CBL基因序列在NCBI上进行BLAST比对，筛选得到10个玉米CBL基因序列。进化树分析发现玉米的CBL分为3个类群，CBL4、CBL5、CBL8分为1个类群，CBL10单独为1类群，其余分为另外1个类群。蛋白结构位点分析发现10个CBL均含有3个EF-hand结构域，并且每个EF-hand手型结构域的大小完全一致，结构域之间的连接区域大小也是相同的情况，只有首尾两端的序列大小存在差异。CBL1、CBL9具有很高的同源性（99%），处于同一个进化分枝,并具有完全一致的EF-hand结构域，推测它们可能具有共同的靶蛋白。（2）在酵母双杂交系统中，以PGBKT7-ZmCIPK8作为诱饵载体，从10个玉米CBL中筛选可以与ZmCIPK8互作的CBLs蛋白。结果发现含有PGADT7-CBL1、PGADT7-CBL4、PGADT7-CBL9质粒的3个转化组在四缺板有菌落生长，X-gal染色实验也发现相应的菌落可以在8h之内显蓝色。推测CBL1、CBL4、CBL9与ZmCIPK8之间可能存在相互作用。它们的基因登陆号分别为EU907931、EU973091、EU960527。（3）为了进一步验证ZmCIPK8与CBL1、CBL4、CBL9在植物体内是否存在相互作用，我们进一步分析了玉米中这4个基因在干旱胁迫下的转录表达情况。ZmCIPK8基因在根与叶中的表达情况相似，都是在30min时段表达量稍微升高，之后逐渐降低。CBL1、CBL4、CBL9基因在胁迫初期的表达量都是有所升高，然后逐渐降低，这为它们可能在植物体内的相互作用提供了依据。（4）为了明确CBL1、CBL4、CBL9在亚细胞中的定位情况，构建了CBL1、CBL4、CBL9基因与eGFP的PS1300融合表达载体。使用农杆菌EH105做介导，通过瞬时表达技术侵染洋葱表皮细胞，共聚焦显微镜观察发现CBL1、CBL4、CBL9定位于细胞膜。

全文目录

致谢  4-9
摘要  9-10
第一章文献综述  10-17
  1.1 植物应对逆境胁迫的调控模式  10
  1.2 植物体内特异钙信号的产生  10-11
  1.3 高等植物中钙离子的靶蛋白  11-13
    1.3.1 CDPK 家族  11
    1.3.2 钙调素类超蛋白  11-12
    1.3.3 CBL 家族  12-13
  1.4 CBL/CIPK 信号系统  13-16
    1.4.1 CIPK 家族  13
    1.4.2 CBL/CIPK 的特异性互作  13-14
    1.4.3 CBLs 与 CIPKs 的亚细胞定位和特异性表达  14-15
    1.4.4 CBL/CIPK 系统与植物的抗逆性  15-16
  1.5 研究目的及意义  16-17
第二章 ZmCIPK8 及 CBLs 序列分析  17-23
  2.1 引言  17
  2.2 方法  17
    2.2.1 ZmCIPK8 及 CBLs 基因序列的获取  17
    2.2.2 蛋白序列分析方法  17
      2.2.2.1 蛋白序列比对  17
      2.2.2.2 进化树分析  17
      2.2.2.3 蛋白功能位点分析  17
  2.3 结果  17-22
    2.3.1 玉米中的 CIPK8 及 CBLs 基因序列  17
    2.3.2 ZmCIPK8 及 10 个 CBL 的蛋白序列分析  17-22
      2.3.2.1 ZmCIPK8 的蛋白序列分析  17-18
      2.3.2.2 10 个 CBL 蛋白序列分析  18-22
  2.4 结论与讨论  22-23
第三章酵母双杂交筛选与 ZmCIPK8 互作的 CBLs  23-44
  3.1 引言  23
  3.2 材料  23-26
    3.2.1 玉米材料与载体  23-24
    3.2.2 实验试剂及仪器  24
    3.2.3 常用试剂及缓冲液配置方法  24-25
    3.2.4 培养基  25-26
  3.3 方法  26-36
    3.3.1 载体构建  26-33
      3.3.1.1 ZmCIPK8 及 CBLs 目的基因的克隆  26-30
      3.3.1.2 PCR 产物的回收  30
      3.3.1.3 回收 DNA 片段连接 PMD19-T 载体  30
      3.3.1.4 连接产物转化大肠杆菌 DH5a  30-31
      3.3.1.5 质粒 DNA 的提取  31-32
      3.3.1.6 质粒鉴定  32-33
      3.3.1.7 测序比对  33
      3.3.1.8 诱饵载体及猎物载体的构建  33
    3.3.2 诱饵的自激活验证  33-34
    3.3.3 共转化法进行酵母双杂交筛选  34-36
      3.3.3.1 酵母感受态的制备  34
      3.3.3.2 共转化  34-35
      3.3.3.3 酵母克隆的阳性鉴定  35
      3.3.3.4 X-gal 染色活性测定  35-36
  3.4 实验结果  36-43
    3.4.1 载体构建  36-39
      3.4.1.1 ZmCIPK8 及 CBLs 基因的克隆  36-37
      3.4.1.2 ZmCIPK8 及 CBLs 基因 PCR 扩增结果  37-38
      3.4.1.3 载体构建  38-39
    3.4.2 自激活检测结果  39-40
    3.4.3 酵母双杂交筛选结果  40-41
    3.4.4 酵母质粒的 PCR 检测  41-42
    3.4.5 X-gal 染色活性结果  42-43
  3.5 讨论  43-44
第四章酵母双杂交筛选出的 CBLs 基因的表达分析和亚细胞定位  44-53
  4.1 引言  44
  4.2 材料  44-45
    4.2.1 玉米材料  44
    4.2.2 洋葱材料  44
    4.2.3 实验试剂及仪器  44
    4.2.4 常用溶液及缓冲液  44
    4.2.5 培养基  44-45
  4.3 方法  45-48
    4.3.1 半定量 RT-PCR  45-46
      4.3.1.1 TRIzol 法提取总 RNA  45
      4.3.1.2 RNA 纯化  45
      4.3.1.3 RNA 反转录成 cDNA  45
      4.3.1.4 RT-PCR  45-46
      4.3.1.5 引物  46
    4.3.2 亚细胞定位  46-48
      4.3.2.1 CBL1、CBL4、CBL9 三个目的基因的扩增  46-47
      4.3.2.2 PS1300-CBL1，PS1300-CBL4，PS1300-CBL9 载体构建  47
      4.3.2.3 质粒转化农杆菌 EH105  47-48
      4.3.2.4 瞬时表达  48
  4.4 结果与分析  48-52
    4.4.1 RT-PCR  48-49
    4.4.2 亚细胞定位  49-51
      4.4.2.1 基因克隆  49-50
      4.4.2.2 融合表达载体的构建  50-51
    4.4.3 亚细胞定位结果  51-52
  4.5 讨论  52-53
参考文献  53-60
英文摘要  60-61

ZmCIPK8互作蛋白CBLs的筛洗

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