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空肠弯曲杆菌生物膜的形成及其特性的研究

作　者: 秦晓庆
导　师: 侯振中
学　校: 东北农业大学
专　业: 兽医产科学
关键词: 空肠弯曲杆菌生物膜体外模刑胞外多糖小鼠氧化抗氧化指标炎性因子
分类号: S852.61
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

空肠弯曲杆菌(Campylobacter Jejuni)是一种人畜共患病的病原菌,在世界范围内引起大规模的感染,该菌对生存条件的要求较为严苛。近年来有学者发现,该菌在一定条件下可以形成一种能够抵抗外界环境不良影响的生物膜,这也是该菌能够在严峻的环境中存活并产生耐药性的重要原因。本研究临床采取猪的盲肠部位作为分离空肠弯曲杆菌的试验样品,对空肠弯曲杆菌进行分离培养,分别采用常规生化鉴定以及PCR检测两种方法对分离到的菌株进行鉴定,比较两种方法的差异。经鉴定确认为空肠弯曲杆菌的菌株,通过结晶紫染色、扫描电镜等方法,确认空肠弯曲杆菌是否具有在体外形成生物膜的能力,建立其生物膜体外模型,并对其形成的过程进行了观察；正交实验法检测空气条件,环境温度以及培养基类型3个因素对空肠弯曲杆菌生物膜形成的影响。结果表明：用厌氧罐与焦性没食子酸结合的方法分离空肠弯曲杆菌是经济有效的；PCR法鉴定空肠弯曲杆菌,相对常规生化方法来说具有省时省力且灵敏准确的优点；分离所得到的空肠弯曲杆菌具有在体外形成生物膜的能力；空肠弯曲杆菌生物膜形成的的最佳条件为常规空气条件,即37℃以及MHB培养基。生物膜菌在其生存方式、胞外物质的合成以及对动物的致病性方面均与浮游菌存在有很大程度的差异,本试验采用蒽酮-硫酸法和考马斯亮蓝法,分别对不同时间生物膜状态和浮游状态下空肠弯曲杆菌合成的胞外多糖和菌体总蛋白量进行测定。结果发现生物膜型细菌在各时间点合成的水溶性胞外多糖的量均低于浮游型细菌,两者之间差异性显著(P<0.05)；而各时间点细菌合成水不溶性多糖的量则是生物膜型细菌高于浮游型细菌,二者在48h时差异不显著(P>0.05),其它时间点差异均显著(P<0.05)。两种状态下菌体总蛋白的量随时间的延长有增加趋势,两者在12h差异不显著(P>0.05),其它时间点差异均显著(P<0.05)。将普通清洁级小鼠用5倍剂量的抗生素处理,消除其肠道共生微生物菌群之后作为研究空肠弯曲杆菌与宿主之间相互作用的动物模型。分别用生物膜型细菌和浮游型的空肠弯曲杆菌感染试验小自鼠,观察小鼠临床症状及出现症状的时间,对攻毒小鼠的外周血进行细胞因子和抗氧化指标的检测,以发现两种状态下的空肠弯曲杆菌对小鼠的致病性,以及对感染小鼠的免疫机能的影响。结果表明,两种状态的细菌感染小鼠后,小鼠未出现明显的临床症状,仅有少数出现了腹泻或精神沉郁,且症状较轻或可以自愈。在经过空肠弯曲杆菌感染后的第1d,生物模型和浮游型的细菌处理的小鼠肝脏匀浆液中可发现细菌定植。两种状态的细菌在肝脏中的生长状态与清除时间明显不同。浮游型的细菌数量在6-7d达到峰值,且在肝脏中的清除时间长达15d。而生物膜型的细菌数量的峰值出现在感染后的第10d,且在肝脏中的清除时间比浮游菌处理组更长。空肠弯曲杆菌虽然是一种众所周知的肠道致病菌,但是却能够引起全身性或系统性的感染,因此空肠弯曲杆菌与宿主免疫之间的相互影响近年来不断受到关注。试验结果证实,对于两种状态的空肠弯曲杆菌感染小鼠的血浆中几种促炎性细胞因子以及抗炎性细胞因子的水平进行了检测,以此来研究该病原菌与宿主的免疫之间的联系。结果显示：感染后第1d起血浆的IFN-γ的水平就出现了一定程度的升高,但并不明显。浮游菌组IFN-γ的峰值出现在第4-7d,而生物膜菌组出现在第10d；浮游菌组TNF-α第4d达到峰值,之后迅速下降。而生物膜菌组峰值出现在第4-7d之间,直至第10d均处于较高水平：两实验组IL-2峰值均出现在感染后的7d左右,同一时间点血浆1L-2水平,生物膜菌组显著高于浮游菌组(P<0.05);IL-4在浮游菌组峰值出现在感染后的第4-7d,之后直至第10d菌居高不下,粘附菌组,感染前期并无显著升高,后期,该细胞因子持续升高且在监控的时间内并未达到峰值;IL-6的水平感染的早期阶段并没有显著增加,从第4d开始显著升高,峰值出现在第7d。归纳来讲,促炎性细胞因子出现在感染的前期阶段,且多在炎症的急性期达到峰值,而抗炎性细胞因子的升高是跟随在促炎性细胞因子升高之后,比较浮游细菌和生物膜型细菌对宿主的免疫防御的影响,可以看出,由粘附细菌引起的感染具有从炎症急性期向慢性化转变的趋势,而宿主的免疫也从先天免疫转向获得性免疫。两种型态的细菌对宿主机体抗氧化系统的影响的研究结果表明：SOD在浮游菌组显著降低(P<0.05):MDA在生物膜菌组显著降低(P<0.05); GSH在两实验组没有出现显著差异：LDH在两个实验组均显著升高(P<0.05),且浮游菌组显著高于生物膜菌组(P<0.05)。综上所述,本试验研究空肠弯曲杆菌生物膜的上述儿个方面取得了阶段性的进展,但是由于细菌生物膜的形成是一个极为复杂的过程,与此相关的影响因素涉及到各个方面,难以逐一模拟研究。另外由于空肠弯曲杆菌自身的特性,对于该菌生物膜的研究还非常有限,在其形成机制,基因水平的调控,以及耐药机制和致病机制等方面还存在很多不解之处,另外由于试验的局限性,体外实验并不能完全模仿体内环境,因此要想对该菌生物膜进行更深入了解还需要后期不断研究。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
1 前言  13-34
  1.1 空肠弯曲杆菌的病原学特征  13-17
    1.1.1 生物学  13-15
    1.1.2 致病性及致病机理  15-17
  1.2 空肠弯曲杆菌的流行病学  17-19
    1.2.1 流行的基本状况  17-18
    1.2.2 传染源、传播途径、易感动物  18-19
  1.3 空肠弯曲杆菌耐药性  19-20
  1.4 空肠弯曲杆菌的诊断方法的研究  20
  1.5 细菌生物膜概述  20-26
    1.5.1 生物膜的形成以及影响因素  21-22
    1.5.2 细菌生物膜的致病机理  22-23
    1.5.3 细菌生物膜的耐药性及耐药机制  23-25
    1.5.4 细菌生物膜鉴定方法的研究进展  25-26
    1.5.5 生物膜菌对机体免疫功能的影响  26
  1.6 细胞因子与抗氧化系统  26-31
    1.6.1 细胞因子  26-28
    1.6.2 抗氧化系统与自由基  28-31
  1.7 空肠弯曲杆菌生物膜的研究进展  31-32
  1.8 研究的目的和意义  32-34
2 试验材料  34-36
  2.1 试验仪器  34
  2.2 试验材料及培养基  34-36
3 试验方法  36-44
  3.1 空肠弯曲杆菌的分离、鉴定  36-38
    3.1.1 空肠弯曲杆菌的分离纯化  36
    3.1.2 鉴定  36-38
    3.1.3 细菌保存  38
  3.2 生物膜体外模型建立  38-39
    3.2.1 生物膜形成能力的分析  38
    3.2.2 光镜及扫描电镜观察  38-39
  3.3 空肠弯曲杆菌生物膜的相关特性的研究  39-41
    3.3.1 环境因素对生物膜形成的影响  39-40
    3.3.2 生物膜菌与浮游菌在合成胞外物质的差异  40-41
  3.4 浮游细菌和粘附细菌对动物致病性的研究  41-44
    3.4.1 菌株处理  41-42
    3.4.2 实验动物的处理  42
    3.4.3 宿主肝脏内细菌清除的研究  42
    3.4.4 小鼠血浆中细胞因子及氧化抗氧化指标的检测  42-44
4 结果  44-61
  4.1 病原菌分离及鉴定  44-46
    4.1.1 空肠弯曲杆菌分离  44
    4.1.2 空肠弯杆菌的鉴定  44-46
  4.2 空弯生物膜体外模型的建立结果  46-48
    4.2.1 空肠弯曲杆菌可形成生物膜能力的分析结果  46-48
  4.3 空弯生物膜相关特性的研究结果  48-53
    4.3.1 环境因素对空肠弯曲杆菌生物膜形成的影响  48-50
    4.3.2 两种细菌胞外多糖和菌体总蛋白的测定  50-52
    4.3.3 菌体总蛋白含量的测定  52-53
  4.4 两种空肠弯曲杆菌对感染动物机体的影响  53-61
    4.4.1 实验动物感染  53
    4.4.2 两种状态空肠弯曲杆菌对动物的致病性  53-54
    4.4.3 两种细菌在实验动物体内的清除情况  54
    4.4.4 感染小鼠血浆中炎性因子和氧化抗氧化指标的检测  54-59
    4.4.5 感染小鼠抗氧化指标的检测  59-61
5 讨论  61-74
  5.1 病原菌分离及鉴定  61
  5.2 C.jejuni生物膜体外模型的建立  61-63
  5.3 空弯生物膜相关特性的研究结果  63-66
    5.3.1 环境因素对空肠弯曲杆菌生物膜形成的影响  63-64
    5.3.2 两种细菌胞外多糖和菌体总蛋白的测定  64-66
  5.4 两种空肠弯曲杆菌对动物的致病性  66-74
    5.4.1 实验动物的处理  66-67
    5.4.2 两种空肠弯曲杆菌对动物的致病性  67
    5.4.3 两种细菌在感染动物肝脏内的清除情况  67-68
    5.4.4 对感染动物细胞因子和氧化抗氧化指标的检测  68-74
6 结论  74-75
致谢  75-76
参考文献  76-88
攻读博士学位期间发表的学术论文  88

空肠弯曲杆菌生物膜的形成及其特性的研究

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