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鸭瘟病毒核糖核苷酸还原酶小亚基（R2）基因原核表达及其转录和表达时相分析

作　者: 魏敏
导　师: 汪铭书
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭瘟病毒 R2基因原核表达转录时相表达时相
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

鸭瘟(Duck plague, DP)是由鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV)(疱疹病毒中的一员)引起鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。本研究对四川农业大学禽病防治中心注册的DPV-CHv株核糖核苷酸还原酶小亚基(the small subunit of ribonucleotide reductase, R2)基因(GenBank登录号：EU071039)进行了生物信息学分析、重组蛋白表达及多克隆抗体制备和转录及表达时相分析,结果如下：1DPV R2基因生物信息学分析。通过对DPV R2基因进行生物信息学分析,结果表明该基因编码的蛋白是由355个氨基酸组成的不稳定的偏酸性的水溶性蛋白,相对分子量约为40.68kDa。还发现该蛋白含有19个磷酸化位点和7个糖基化位点,没有信号肽切割位点,有跨膜区,且该蛋白主要定位于细胞质和细胞核。另外,通过对DPV R2蛋白氨基酸序列与其它疱疹病毒R2蛋白氨基酸序列相似性和系统进化关系析表明,DPV与Alphaherpesvirinae亚科中Mardivirus属的疱疹病毒有很高的同源性。2DPV R2重组蛋白表达及多克隆抗体制备。根据DPV R2基因序列,设计了一对引物用于扩增R2基因,并根据对DPV R2基因所编码的蛋白的生物信息学分析和以往对疱疹病毒R2基因表达的经验,利用原核表达系统pET32a(+),在低温(25℃)、低IPTG浓度(0.2mmol/L)和长时间(12h)诱导的条件下表达重组蛋白DPV R2,经SDS-PAGE分析表明重组蛋白大小约为64kDa,且主要以可溶性形式存在于上清中；表达的重组蛋白采用兔抗DPV血清作为一抗经过Western Blotting证实,该蛋白与兔抗DPV血清具有很好的反应原性；随后,将纯化的重组蛋白用于制备兔抗多克隆抗体,通过琼脂扩散试验测定效价为1：32。3DPV R2基因转录和表达时相分析。根据DPV R2基因序列,设计了一对引物用于转录时相分析。通过药物抑制试验研究DPV R2基因的转录类型,结果表明,DPV R2基因是一个早期基因；另外,通过实时荧光定量PCR和Western Blotting分析DPV R2基因的转录和表达时相,结果表明R2基因的转录和表达动态于DPV感染后1h后即可被检测到,而且随着感染时间的延长,其转录和表达水平也随之增加,且转录水平在56h时达到高峰期,之后稳定在比较高的水平。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一部分引言  9-13
  第一章文献综述和试验目的  9-13
    1 文献综述  9-11
      1.1 疱疹病毒R2基因及其编码蛋白  9-11
        1.1.1 疱疹病毒R2基因  9-10
        1.1.2 疱疹病毒R2蛋白  10-11
      1.2 鸭瘟病毒  11
    2 实验目的  11-13
第二部分试验  13-37
  第二章鸭瘟病毒R2基因生物信息学分析  13-20
    1 材料  13-14
    2 方法  14-15
    3 结果  15-19
      3.1 DPV R2基因所编码的氨基酸序列序列相似性比较及进化关系分析  15-16
      3.2 DPV R2蛋白的理化性质分析  16-17
      3.3 DPV R2蛋白的结构功能分析  17-18
      3.4 DPV R2蛋白的亚细胞定位分析  18
      3.5 DPV R2蛋白的二级结构分析  18-19
    4 讨论  19-20
  第三章鸭瘟病毒R2重组蛋白表达及多克隆抗体制备  20-29
    1 材料  20-21
      1.1 毒株、载体、菌株、鸭胚和动物  20
      1.2 主要试剂  20
      1.3 主要仪器设备  20-21
    2 方法  21-25
      2.1 引物合成  21
      2.2 扩增鸭瘟病毒R2基因  21
        2.2.1 鸭瘟病毒DNA提取  21
        2.2.2 扩增鸭瘟病毒R2基因  21
      2.3 构建及鉴定pMD20-T/R2克隆载体  21-22
        2.3.1 构建pMD20-T/R2克隆载体  21-22
        2.3.2 鉴定pMD20-T/R2克隆载体  22
      2.4 构建及鉴定pET32a/R2表达载体  22
        2.4.1 构建pET32a/R2表达载体  22
        2.4.2 鉴定pET32a/R2表达载体  22
      2.5 表达及纯化DPV R2重组蛋白  22-24
        2.5.1 转化pET32a/R2表达载体  22-23
        2.5.2 表达重组蛋白DPV R2  23
        2.5.3 检测重组蛋白DPV R2的反应原性  23
        2.5.4 纯化重组蛋白DPV R2  23-24
      2.6 制备及纯化兔抗重组蛋白DPV R2多克隆抗体  24-25
        2.6.1 制各兔抗重组蛋白DPV R2多克隆抗体  24
        2.6.2 纯化兔抗重组蛋白DPV R2多克隆抗体  24-25
    3 结果  25-28
      3.1 鸭瘟病毒R2基因的扩增  25
      3.2 克隆载体pMD20-T/R2的鉴定  25
      3.3 表达载体pET32a/R2的鉴定  25-26
      3.4 重组蛋白DPV R2的表达及纯化  26
      3.5 重组蛋白DPV R2的反应原性检测  26
      3.6 兔抗重组蛋白DPV R2多克隆抗体效价测定及纯化  26-28
    4 讨论  28-29
  第四章鸭瘟病毒R2基因转录及表达时相研究  29-37
    1 材料  29-30
      1.1 毒株、菌株、抗体和鸭胚  29
      1.2 主要试剂  29
      1.3 主要仪器设备  29-30
    2 方法  30-32
      2.1 引物合成  30
      2.2 鸭瘟病毒R2基因转录类型研究  30-31
        2.2.1 细胞培养及鸭瘟病毒RNA提取  30
        2.2.2 反转录制备cDNA  30-31
        2.2.3 普通PCR检测样品  31
      2.3 鸭瘟病毒R2基因转录时相研究  31
        2.3.1 实时荧光定量PCR标准曲线制作  31
        2.3.2 鸭瘟病毒R2基因转录时相研究  31
      2.4 鸭瘟病毒R2基因表达时相研究  31-32
    3 结果  32-35
      3.1 药物抑制试验鉴定鸭瘟病毒R2基因转录类型  32
      3.2 实时荧光定量PCR标准曲线制作  32-33
      3.3 鸭瘟病毒R2基因转录时相分析  33-35
      3.4 鸭瘟病毒R2基因表达时相分析  35
    4 讨论  35-37
第三部分结论  37-38
第四部分参考文献  38-43
致谢  43-44
作者简介及攻读硕士学位期间论文发表  44

鸭瘟病毒核糖核苷酸还原酶小亚基（R2）基因原核表达及其转录和表达时相分析

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