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鸭瘟病毒VP19c蛋白的表达、细胞内定位及RNA干扰抑制病毒复制的初步研究

作　者: 向骏
导　师: 程安春；汪铭书
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭瘟病毒 UL38基因 VP19c蛋白原核表达表达时相细胞内定位融合表达绿色荧光蛋白 RNA干扰短发夹RNA
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目前,还未见到有关DPV VP19c蛋白的深入研究报道。本试验通过对本实验室在NCBI GeneBank注册的DPVUL38基因(登录号为EU071041)进行了生物信息学分析、克隆和原核表达、重组蛋白纯化和多克隆抗体制备、表达时相和细胞内定位、RNAi靶向UL38基因抑制DPV复制的研究,结果如下：1.UL38基因的生物信息学分析通过对UL38基因及其编码蛋白的结构、功能位点、抗原性以及稀有密码子等进行了全面的生物信息学分析,结果显示DPV UL38基因包含1个保守结构域,与多种α疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性。其编码产物不含有信号肽、跨膜区,可以定位于细胞核,抗原表位较多且在N端相对较多,不含有多个连续的稀有密码子。2.UL38基因的克隆、原核表达及抗体制备在上述分析基础上克隆了该基因并利用原核表达系统pET-32a(+),分别表达了完整ORF编码产物和部分ORF编码产物,经SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小分别约为66kDa和45 kDa, Western blot分析表达产物均可与兔抗DPV多克隆抗体发生特异性免疫反应,ELISA分析表明两个蛋白的抗原性接近。纯化重组蛋白,然后免疫家兔制备了相应的多克隆抗体,琼扩效价为l:8. Western blot表明制备的抗血清能特异与病毒粒子反应。3.VP19c蛋白的表达时相和细胞内定位通过Western blot确定UL38基因编码蛋白的表达时相,发现最早在病毒感染细胞后8h检测到该蛋白,这与疱疹病毒典型的晚期蛋白表达谱是一致的。通过间接免疫荧光试验确定UL38基因编码蛋白的细胞内定位,发现最早在病毒感染细胞后8h检测到荧光在细胞质,随后逐渐靠近细胞核,在30h集中于细胞核内。为进一步确定该蛋白的定位,构建了融合表达绿色荧光蛋白载体,将质粒转染鸭胚成纤维细胞,通过荧光显微镜观察证实了该蛋白能主动定位于细胞核,说明其存在核定位信号。4. RNAi靶向UL38基因抑制DPV复制目前,还未见到通过构建RNA干扰载体抑制DPV复制的研究报道。本试验根据DPV CHv株UL38基因序列、水禽类已知基因序列以及短发夹RNA表达载体要求和RNA干扰靶位序列选择原则,应用BLAST工具筛选出3条特异性地针对DPV CHv株的小干扰RNA序列,然后送往上海吉凯公司构建表达载体。将构建好的干扰质粒与融合表达绿色荧光蛋白质粒共转染鸭胚成纤维细胞,荧光显微镜观察可见其中1个干扰载体表现出较好的抑制效果。随后将筛选的效果最好的干扰质粒转染鸭胚成纤维细胞,6h后接种病毒,通过观察细胞病变来判断RNA干扰对DPV在细胞中复制的影响情况。试验结果显示,该干扰载体对病毒在细胞中的增殖具有一定的抑制作用。

鸭瘟病毒VP19c蛋白的表达、细胞内定位及RNA干扰抑制病毒复制的初步研究

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