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新城疫病毒VG/GA毒株反向遗传系统的建立及最佳外源基因表达位置的确定

作　者: 赵伟
导　师: 杨增岐
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 嗜肠性新城疫病毒 VG/GA毒株反向遗传系统绿色荧光蛋白外源基因表达
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种禽类急性高度接触性传染病。新城疫自发现以来，已有多次世界范围内的大流行，给世界养禽业构成了严重威胁，是目前世界范围内最严重的家禽传染病之一。NDV一般分为三种致病型，即缓发型、中发型和速发型。其中,速发型NDV又分为嗜肺脑型和嗜内脏型。速发嗜内脏型NDV以消化道出血性病变为主要特征，致死率高达90%以上。虽然自NDV反向遗传系统建立以来，已有多个毒株被成功拯救，但是，我们应当注意到，目前拯救的NDV大多为嗜呼吸道的弱毒株，而嗜肠性NDV的反向遗传学系统却一直未有报道，这也导致了嗜肠性NDV分子生物学及疫苗学研究的滞后。NDV VG/GA疫苗毒株不仅能够在禽类呼吸道和肠道中繁殖，而且还可以刺激机体在呼吸道和消化道中产生坚实的免疫力，使其免受NDV强毒的攻击，因此，NDV VG/GA毒株目前已经成为世界范围内预防新城疫，尤其是预防速发嗜内脏型新城疫，使用最为广泛的NDV肠道疫苗。本实验中，为了建立嗜肠性NDV的反向遗传系统，给后期嗜肠型疫苗的研究提供技术平台，我们以NDV VG/GA毒株作为亲本病毒，首先将涵盖其基因组全长序列的四个RT-PCR片段依次连接到转录载体当中，成功构建出了VG/GA毒株的全长cDNA克隆。之后，采用表达T7聚合酶的重组鸡痘病毒（MVA/T7）预先感染Hep-2细胞，然后共转染辅助质粒与全长cDNA克隆的方式,成功拯救出了具有感染性的NDV rVG/GA病毒，并通过HA、HI以及全基因组测序的方法确认了拯救病毒rVG/GA的确来自感染性克隆。另外，EID50、TCID50、MDT、ICPI以及生长曲线等多项生物学特性指标也显示，拯救病毒rVG/GA不仅很好地保持着亲本病毒VG/GA的生物学特性，而且，其复制特性及生长动力学特性也极其相似，这说明，NDV VG/GA病毒拯救成功。为了进一步确定NDV VG/GA载体外源基因的最佳表达位置，在前一章成功建立NDV VG/GA毒株反向遗传系统的基础上，我们先后将绿色荧光蛋白GFP插入到NDVVG/GA载体的NP与P基因之间、P与M基因之间、M与F基因之间、F与HN基因之间以及HN与L基因之间，成功构建并拯救了一系列GFP插入位置不同的重组新城疫病毒。EID50、TCID50、MDT、ICPI等多项生物学特性指标显示，拯救病毒rVG/GA-GFP-NP/P、 rVG/GA-GFP-P/M、 rVG/GA-GFP-M/F、 rVG/GA-GFP-F/HN及rVG/GA-GFP-HN/L依然很好地保持着亲本病毒rVG/GA弱毒株的生物学特性，未有任何毒力增强现象发生。同时，病毒生长曲线结果显示，虽然所有拯救病毒均表现出了与rVG/GA病毒相似的复制特性及生长动力学特性，但是，GFP基因插入的位置对病毒复制效率有着较大的影响。具体表现为，GFP基因越靠近病毒基因组的3`端，病毒的生长越滞后。之后，我们又利用Real-time PCR和多功能酶标仪等手段，在转录水平以及蛋白水平分别对重组病毒GFP基因的表达进行了鉴定，结果不仅首次系统地证实了NDVmRNA转录量按照基因组3`至5`顺序依次递减的理论，而且更重要的是，实验结果显示，相比较其他插入位点，当GFP位于NDV VG/GA载体P与M基因之间时，外源蛋白的表达量最高。这说明，综合考虑NDV基因组mRNA的转录特性与外源基因对病毒复制所产生的影响，NDV VG/GA基因组P与M基因之间的非编码区是表达外源基因的最佳位置。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-26
  1.1 NDV 分子生物学研究进展  11-18
    1.1.1 NDV 病原研究  11-13
    1.1.2 NDV 分子生物学特性  13-17
    1.1.3 NDV 的转录与复制  17-18
  1.2 负链 RNA 病毒反向遗传操作系统  18-25
    1.2.1 反向遗传学的概念  18
    1.2.2 反向遗传操作系统原理与方法  18-19
    1.2.3 RNA 病毒反向遗传系统的建立  19-20
    1.2.4 NDV 反向遗传系统的建立  20-22
    1.2.3 NDV 反向遗传学的应用  22-25
  1.3 结语  25-26
第二章 NDV VG/GA 毒株反向遗传系统的建立  26-43
  2.1 材料与方法  27-35
    2.1.1 材料  27-28
    2.1.2 方法  28-35
  2.2 结果  35-40
    2.2.1 目的片段的 PCR 扩增结果  35-36
    2.2.2 NDV VG/GA 毒株全基因组测序结果  36
    2.2.3 NDV VG/GA 毒株全长 cDNA 质粒的构建  36-38
    2.2.4 NDV rVG/GA 拯救病毒的鉴定  38-39
    2.2.5 NDV rVG/GA 拯救病毒的生物学特性  39
    2.2.6 NDV rVG/GA 拯救病毒的生长曲线  39-40
  2.3 讨论  40-42
  2.4 小结  42-43
第三章 NDV rVG/GA 毒株外源基因最佳表达位置的确定  43-68
  3.1 材料与方法  44-53
    3.1.1 材料  44-45
    3.1.2 方法  45-53
  3.2 结果  53-64
    3.2.1 目的片段的 PCR 扩增结果  53
    3.2.2 重组质粒 pVG/GA-GFP-NP/P、pVG/GA-GFP-P/M、pVG/GA-GFP-M/F、pVG/GA-GFP-F/HN 及 pVG/GA-GFP-HN/L 的构建  53-55
    3.2.3 拯救病毒 rVG/GA-GFP-NP/P、rVG/GA-GFP-P/M、rVG/GA-GFP-M/F、rVG/GA-GFP-F/HN 及 rVG/GA-GFP-HN/L 的鉴定  55-58
    3.2.4 拯救病毒 rVG/GA-GFP-NP/P、rVG/GA-GFP-P/M、rVG/GA-GFP-M/F、rVG/GA-GFP-F/HN 及 rVG/GA-GFP-HN/L 的生物学特性  58
    3.2.5 拯救病毒 rVG/GA-GFP-NP/P、rVG/GA-GFP-P/M、rVG/GA-GFP-M/F、rVG/GA-GFP-F/HN 及 rVG/GA-GFP-HN/L 的生长曲线  58-60
    3.2.6 转录水平检测拯救病毒 rVG/GA-GFP-NP/P 、 rVG/GA-GFP-P/M 、rVG/GA-GFP-M/F、rVG/GA-GFP-F/HN 及 rVG/GA-GFP-HN/L GFP mRNA 的表达量  60-64
  3.3 讨论  64-67
  3.4 小结  67
  3.5 结论  67-68
参考文献  68-75
致谢  75-76
个人简历  76
博士期间发表论文情况  76

新城疫病毒VG/GA毒株反向遗传系统的建立及最佳外源基因表达位置的确定

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