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RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传操作系统的建立及RHDV VP60基因的表达

作　者: 禹思宇
导　师: 范红结；王贵平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 反向遗传系统 猫杯状病毒 遗传标记 感染性cDNA分子克隆 兔出血症病毒VP60
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 12次
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内容摘要


应用反向遗传系统实现RNA病毒的拯救,从而在DNA水平上对RNA病毒进行遗传操作,为深入研究RNA病毒的分子生物学及病毒与宿主的相互作用提供了新的手段。绝大多数杯状病毒不能够在体外培养,严重阻碍了这类病毒的研究,猫杯状病毒为杯状病毒科中少数能在体外培养的病毒之一,本研究选择猫杯状病毒CH-GD分离株,克隆其全基因组cDNA,尝试建立RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传系统,拯救含遗传标记的FCV。1.FCV CH-GD株全长cDNA分子克隆设计并合成了覆盖FCV CH-GD株基因组的]对引物,以本实验室保存的含有FCV CH-GD株全长基因组的pUC-FCV质粒为模板,采用PCR方法扩增FCV全长基因组。通过沉默突变引入一分子标记(MluⅠ识别位点)以便于区分野毒株和拯救毒。改造pCDNA载体,并在其3端引入核酶(pCDNA-HDVRZ)。(?)(?)CH-GD株全基因组插入载体,构建CH-GD株基因组的全长cDNA克隆(pCDNA-HDVRZ-FCV),并以PCR、限制性内切酶酶切和基因组测序等方法对pCDNA-HDVRZ-FCV进行鉴定,结果表明已成功构建了FCV CH-GD株的全长cDNA分子克隆。该克隆不仅含有CH-GD株的全基因组序列,还含有核酶序列和一个分子标记(MluⅠ识别位点)。2.拯救病毒的鉴定以pCDNA-HDVRZ-FCV为模板,用脂质体转染法(LipofectamineTM 2000)将FCV基因组全长cDNA分子克隆导入F81细胞,利用聚合酶Ⅱ系统进行体内转录。盲传三代后可观察到典型的FCV致细胞病变效应。使用RT-PCR方法进行鉴定,结果表明拯救病毒成功,获得了感染性cDNA分子克隆。通过对感染性分子克隆分子标志的鉴定,排除了自然毒株的污染。3. RHDV VP60在F81细胞上的表达用KpnⅠ和NotⅠ分别将本实验室构建的两个转移载体和pUC-FCV进行双酶切,采用粘端连接将RHDV VP60基因带入FCV全基因组中不同位点。成功构建了将RHDV VP60插入FCV全基因组中的质粒(LC之后和VP1之后)。采用脂质体转染法将质粒导入F81细胞,转染48h后,应用间接免疫荧光法能够检测到RHDV VP60的表达,继续传代,发现荧光变弱,至第七代检测不到荧光,RT-PCR结果也为阴性。试验结果表明,重组病毒可以在F81细胞中表达VP60,但是不能形成稳定的可感染的重组病毒。总之,FCV反向遗传研究系统的建立将为深入研究其功能基因组学以及致病和变异的分子机制奠定基础,同时还具有将FCV开发成载体用于基因治疗或研发新型疫苗的潜在应用前景。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11第一篇 文献综述  11-43  第一章 FCV反向遗传学的研究进展  11-29    1 猫杯状病毒分子生物学研究进展  11-16      1.1 FCV的形态  11-12      1.2 基因组结构  12-13      1.3 RNA  13      1.4 结构蛋白  13-14      1.5 非结构蛋白  14-15      1.6 ORF3  15      1.7 病毒的繁殖与复制  15-16    2 动物RNA病毒的反向遗传学  16-24      2.1 概念与原理  16-17      2.2 正链RNA病毒反向遗传学发展历程  17-18      2.3 反向遗传学研究系统构建的策略  18-20      2.4 反向遗传操作技术的应用与展望  20-23      2.5 杯状病毒反向遗传学的应用  23-24    3 小结  24-25    参考文献  25-29  第二章 RHDV及VP60基因工程疫苗研究进展  29-43    1 兔出血症的基本特性  29    2 病毒基因组及重要结构和功能蛋白的特性  29-33      2.1 RHDV基因组结构及其功能  29-30      2.2 亚基因组  30-31      2.3 结构蛋白  31-32      2.4 非结构蛋白  32-33    3 VP60基因工程疫苗研究进展  33-37      3.1 肠杆菌表达的亚单位疫苗  33-34      3.2 杆状病毒-昆虫细胞系统表达的亚单位疫苗  34-35      3.3 酵母重组亚单位疫苗  35      3.4 转基因植物表达的亚单位疫苗  35-36      3.5 重组病毒活载体疫苗  36-37    4 小结  37-39    参考文献  39-43第二篇 试验研究  43-83  第一章 RNA聚合酶Ⅱ介导的FCV反向遗传操作系统的建立  43-65    1 材料  43-44      1.1 细胞及培养基  43-44      1.2 载体与质粒  44      1.3 酶和试剂  44      1.4 仪器设备  44    2 方法  44-53      2.1 FCV全长的扩增及遗传标记的引入  44-45      2.2 PCR  45      2.3 pcDNA3载体的改造  45-46      2.4 PCR产物的连接、转化与阳性克隆质粒的鉴定  46-48      2.5 连接产物的转化  48-49      2.6 全基因组真核表达载体的构建  49-50      2.7 病毒的拯救  50-51      2.8 感染性克隆的鉴定  51-53    3 结果  53-58      3.1 FCV全长的扩增  53-54      3.2 pcDNA3载体的改造  54-55      3.3 核酶的引入  55      3.4 全基因组感染性克隆的构建  55-56      3.5 转染敏感细胞  56-57      3.6 RT-PCR鉴定  57      3.7 拯救毒与亲本毒的区别鉴定  57-58      3.8 拯救毒与亲本毒复制动力学比较  58    4 讨论  58-61      4.1 RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)介导的拯救系统  59      4.2 影响病毒转录体感染性的主要因素  59-60      4.3 体内转染时各参数的影响  60-61    5 小结  61-62    参考文献  62-65  第二章 RHDV VP60在F81细胞中的表达  65-83    1 材料  65-66      1.1 细胞及培养条件  65-66      1.2 试剂  66      1.3 主要仪器设备  66      1.4 仪器设备  66    2 方法  66-71      2.1 嵌合体病毒载体的构建  66-68      2.2 阳性克隆的筛选  68-69      2.3 转染敏感细胞  69      2.4 VP60的表达  69-70      2.5 表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  70-71    3 结果  71-77      3.1 重组质粒的鉴定  71-74      3.2 嵌合体病毒VP60的表达  74-77    4 讨论  77-79    5 小结  79-80    参考文献  80-83全文总结  83-85附录 实验所需试剂配制  85-87致谢  87

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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