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用于疾病防治的欧洲鳗鲡肠道益生菌的研究

作　者: 张子华
导　师: 纪荣兴；鄢庆枇
学　校: 集美大学
专　业: 水产养殖
关键词: 欧洲鳗鲡益生菌嗜水气单胞菌绿色荧光蛋白定植
分类号: S94
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本文从欧洲鳗鲡肠道中筛选出嗜水气单胞菌的拮抗菌,通过对拮抗菌的理化指标测试来进一步筛选出三株菌,利用绿色荧光蛋白对其进行标记,得到能稳定表达绿色荧光蛋白的菌株E-Aa3-22,最后研究该标记菌在欧洲鳗鲡肠道中的定植作用。用点种法从欧洲鳗鲡肠道菌群中筛选出65株病原性嗜水气单胞菌的拮抗菌,进一步研究拮抗效果最好的14株拮抗菌的抗菌谱、生长曲线以及与病原性嗜水气单胞菌的共凝集作用。研究结果显示:从NAC琼脂培养基筛选的2株拮抗菌(Na3-38和Nb3-15)对7株指示菌均有较强的拮抗作用,Aa3-22和Mb3-7对7株指示菌中的5株有拮抗效果;除Na3-38和Nb3-15以外其余12株的生长参数均大于嗜水气单胞菌;有11株拮抗菌(Na3-38、Nb3-15、Ab2-55、Ab2-77、Ab1-3、Aa3-22、Aa3-67、Mb1-4、Mb2-10、Mb3-7和Mb3-27)和嗜水气单胞菌的共凝集率大于10%。这些结果表明:Aa3-22和Mb3-7在抗菌谱、生长曲线以及与共凝集作用三个方面都适合作为益生菌,Na3-38和Nb3-15除了生长参数略低于嗜水气单胞菌外,在抗菌谱和共凝集方面明显高于其他菌株。本研究通过构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒,并利用其标记欧洲鳗鲡肠道候选益生菌。首先设计合成扩增EGFP基因的引物,该引物含有HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,以质粒pEGFP-C1为模板利用Pfu DNA聚合酶PCR扩增EGFP的cDNA序列,接着利用Taq DNA聚合酶在EGFP序列两3’端加“A”并纯化,与pMD18-T vector连接后转化至感受态大肠杆菌Top10,正确重组的质粒命名为T-EGFP。然后把重组质粒和载体质粒pET32a进行双酶切,纯化连接后转化至大肠杆菌BL21,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,将获取正确重组的表达型质粒命名为p-EGFP。将表达型质粒转化至候选益生菌Aa3-22、Mb3-27和Na3-38的感受态细胞中,结果显示在菌株Aa3-22中能够稳定表达,编号为E-Aa3-22。通过绿色荧光蛋白标记研究欧洲鳗鲡候选益生菌E-Aa3-22在欧洲鳗鲡肠道的定植作用。E-Aa3-22首先定植于欧鳗肠道的前肠与中肠,在灌胃后3 h时前肠、中肠和内容物的E-Aa3-22已达到10~4 cfu/g,后肠还未出现E-Aa3-22。E-Aa3-22可以抑制其他细菌的定植,致使灌胃后6h前肠和中肠的可培养的异养细菌总数显著降低。E-Aa3-22可以定植在欧洲鳗鲡肠道并增殖,在灌胃后的24-36h,肠壁中的标记菌达到最大值1.0×10~5 cfu/g左右,至96 h仍大于1.0×10~3 cfu/g;内容物中的E-Aa3-22在36 h达到最大值,60 h则未能检出。不同肠段的消化酶活力都表现为前肠>中肠>后肠,不同部位酶活性差异极显著(P<0.01),E-Aa3-22的定植对试验组的前肠段脂肪酶活力和蛋白酶活力有极显著的抑制作用(P<0.01),对淀粉酶活力以及中后肠段的脂肪酶活力、蛋白酶活力的抑制作用不显著(P>0.05)。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章引言  12-25
  1.1 益生菌的作用机理及其在水产养殖中的应用  13-22
    1.1.1 益生菌概念的发展  13-14
    1.1.2 益生菌的特点及分类  14-16
    1.1.3 益生菌的作用机理  16-21
    1.1.4 益生菌在水产中的应用  21-22
  1.2 鳗鲡  22-24
    1.2.1 鳗鲡的生物学特性及其养殖状况  22
    1.2.2 鳗鲡的主要病害  22-24
    1.2.3 益生菌在鳗鲡中的应用  24
  1.3 研究的目的及意义  24-25
第二章鳗鲡肠道中嗜水气单胞菌的拮抗菌的筛选  25-32
  2.1 材料和方法  25-27
    2.1.1 材料  25-26
    2.1.2 拮抗菌的筛选  26
    2.1.3 抗菌谱测试  26
    2.1.4 生长曲线测试  26
    2.1.5 共凝集  26-27
  2.2 结果  27-30
    2.2.1 拮抗菌的筛选  27
    2.2.2 抗菌谱  27-28
    2.2.3 生长曲线  28
    2.2.4 共凝集效果  28-30
  2.3 讨论  30-32
第三章绿色荧光蛋白原核表达质粒的构建及其在标记欧洲鳗鲡肠道细菌中的表达  32-40
  3.1 材料与方法  32-34
    3.1.1 材料  32
    3.1.2 方法  32-34
  3.2 结果  34-38
    3.2.1 PCR 扩增EGFP 片段  34
    3.2.2 T/A 克隆构建T-EGFP 重组质粒  34-36
    3.2.3 p-EGFP 重组质粒的构建  36
    3.2.4 CaC1_2 法转化Aa3-22、M63-27 和Na3-38  36
    3.2.5 绿色荧光蛋白表达鉴定  36-37
    3.2.6 转化子E-Aa3-22 的蛋白表达稳定性试验  37-38
  3.3 讨论  38-40
第四章候选益生菌对欧洲鳗鲡肠道的定植作用  40-49
  4.1 材料与方法  40-42
    4.1.1 材料  40-41
    4.1.2 方法  41-42
  4.2 结果  42-47
    4.2.1 对照组欧洲鳗鲡肠道和内容物中的异养细菌数  42
    4.2.2 试验组欧洲鳗鲡肠道和内容物中的异养细菌数  42-43
    4.2.3 试验组欧洲鳗鲡肠道和内容物中标记菌E-Aa3-22 的数量  43-44
    4.2.4 E-Aa3-22 占异养细菌总数的比例  44
    4.2.5 欧洲鳗鲡肠道脂肪酶活力  44-46
    4.2.6 欧洲鳗鲡肠道淀粉酶活力  46
    4.2.7 欧洲鳗鲡肠道蛋白酶活力  46-47
  4.3 讨论  47-49
第五章小结与展望  49-50
  5.1 小结  49
  5.2 展望  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-59
附录  59-65
在学期间发表的学术论文  65

用于疾病防治的欧洲鳗鲡肠道益生菌的研究

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