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一株抗白色假丝酵母菌的解淀粉芽孢杆菌的初步研究

作　者: 赵明鑫
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物学
关键词: 解淀粉芽孢杆菌 白色假丝酵母 脂肽 发酵优化 抑菌机理
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


芽孢杆菌次级代谢产物中的抑菌物质主要是脂肽（lipopeptide）类化合物，主要包括表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和丰原素（fengycin）3大类，它们通常具有抑制细菌、真菌、病毒以及支原体的作用，对由真菌或病毒引起的疾病的治疗工作具有重要的研究意义。脂肽分子由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，正由于它的两亲性结构特点，在食品工业、医药、农业生产等方面都有着广泛的应用价值。本论文从多株有抑制真菌能力的菌株中筛选出抑菌活性最强的anti-CA菌株。通过对该菌株菌落形态鉴定以及16S rDNA序列分析，结果表明该菌株与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）特征相符，并且16S rDNA序列具有高度的同源性，因此鉴定为解淀粉芽孢杆菌。anti-CA菌株能够杀死人类条件致病菌白色假丝酵母菌（Candida albicans）。通过对anti-CA菌株产抗菌活性物质的培养条件优化，确定了该菌株产抗菌活性物质的最佳培养条件为：豆饼粉2.0%（w/v），面粉1.0%（w/v），pH6.5，培养温度28℃，180rpm振荡培养27h。通过2-L发酵罐进行发酵实验，结果表明anti-CA菌株发酵培养21h时进入生长稳定期，菌体量保持在3.3×108个/mL，发酵27h时抗菌活性物质抑菌效果达到最大，经抑菌活性实验检测抑菌圈直径为31.33mm，发酵时间为33h时进入衰亡期。酶活力测定结果显示淀粉酶活力可达110.75U/mL，蛋白酶活力可达到3.82U/mL，为以后anti-CA菌株工业化大规模发酵生产抗菌活性物质奠定了基础。发酵上清液经过酸沉淀、抽提，薄层层析和高效液相色谱法（HPLC）等步骤分离纯化出一种抗菌脂肽。质谱分析表明，此脂肽分子量为1021，分子式为C52H91N7O13。纯化的抗菌脂肽在28℃，pH为7.0的抑菌检测平板上对C. albicans抑菌活力最高。对纯化的anti-CA菌株抗菌脂肽的抑菌机理进行初步探究：纯化的抗菌脂肽不仅可以杀死完整的敏感酵母C. albicans细胞，也可以杀死C. albicans细胞的原生质体。电镜检测发现，被抗菌脂肽处理过的C. albicans细胞的细胞壁表面内陷并且发生皱褶，细胞内基质外泄。荧光染料染色检测发现，经过抗菌脂肽处理后的C. albicans细胞可以被PI染料染成红色，而正常细胞不被染色，这说明了该抗菌脂肽能够破坏敏感酵母菌C. albicans细胞膜的通透性。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-12
第一章 绪论  12-23
  1.1 前言  12-13
  1.2 解淀粉芽孢杆菌的应用现状  13-14
    1.2.1 农业生产领域  13-14
    1.2.2 工业生产领域  14
  1.3 解淀粉芽孢杆菌的抗菌脂肽介绍  14-18
    1.3.1 表面活性素（surfactin）  15-16
    1.3.2 伊枯草菌素（iturin）  16-17
    1.3.3 丰原素（fengycin）  17-18
  1.4 抗菌脂肽的作用机制  18-20
    1.4.1 细胞膜损伤机制  18-19
    1.4.2 细胞内损伤机制  19-20
  1.5 抗菌脂肽的研究发展前景  20
    1.5.1 环境生物修复  20
    1.5.2 医学领域  20
    1.5.3 食品工业  20
  1.6 本研究的目的意义以及内容  20-23
第二章 有抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌的筛选和鉴定  23-34
  2.1 引言  23
  2.2 实验材料  23-24
    2.2.1 菌株  23
    2.2.2 培养基  23-24
  2.3 实验方法  24-27
    2.3.1 抑菌菌株抑菌活性的检测  24
    2.3.2 高抑菌活性的菌种筛选  24-25
    2.3.3 菌体和菌落形态特征和淀粉蛋白质水解实验  25
    2.3.4 菌株分子生物学鉴定  25-26
    2.3.5 高抑菌活性菌株的杀菌谱测定  26-27
  2.4 结果与讨论  27-32
    2.4.1 抑菌菌株抑菌活性的检测实验结果  27-28
    2.4.2 常规形态特征鉴定和淀粉蛋白质水解实验结果  28-30
    2.4.3 目标菌株分子生物学鉴定结果  30-32
  2.5 本章小结  32-34
第三章 anti-CA 菌株发酵培养基的优化和抗菌条件的优化  34-44
  3.1 前言  34
  3.2 实验材料  34
    3.2.1 菌株和培养基  34
  3.3 实验方法  34-36
    3.3.1 anti-CA 菌株发酵培养基豆饼粉浓度的优化  34-35
    3.3.2 anti-CA 菌株发酵培养基的碳源优化  35
    3.3.3 anti-CA 菌株在不同发酵条件下抑菌活性的测定  35-36
    3.3.4 接种量对菌体生长及抑菌活性的影响  36
    3.3.5 解淀粉芽孢杆菌 anti-CA 菌株抑菌活性物质在不同抑菌条件下的活性测定  36
  3.4 结果与讨论  36-43
    3.4.1 anti-CA 菌株发酵培养基的豆饼粉优化实验结果  36-37
    3.4.2 anti-CA 菌株发酵培养基的碳源优化实验结果  37-38
    3.4.3 anti-CA 菌株在不同发酵条件下抑菌活性的测定实验结果  38-40
    3.4.4 不同接种量对菌体生长及抑菌活性的影响  40-41
    3.4.5 anti-CA 菌株抑菌活性物质在不同抑菌条件下的活性测定实验结果  41-43
  3.5 本章小结  43-44
第四章 解淀粉芽孢杆菌的发酵及抗菌脂肽的分离纯化  44-58
  4.1 前言  44
  4.2 实验材料  44-45
    4.2.1 菌株  44
    4.2.2 培养基  44
    4.2.3 试剂和设备  44-45
  4.3 实验方法  45-48
    4.3.1 发酵实验  45-46
    4.3.2 抑菌活性物质的提取分离  46-47
    4.3.3 抑菌活性物质的性质研究  47-48
  4.4 实验结果与讨论  48-57
    4.4.1 利用 2-L 发酵罐发酵 anti-CA 菌株实验结果  48-50
    4.4.2 anti-CA 菌株发酵产生的抑菌活性物质的提取分离实验结果  50-53
    4.4.3 解淀粉芽孢杆菌 anti-CA 菌株抗菌脂肽的性质分析  53-57
  4.5 本章小结  57-58
第五章 anti-CA 菌株抗菌脂肽的抑菌机理的初步研究  58-65
  5.1 前言  58
  5.2 实验材料与方法  58-60
    5.2.1 实验菌株  58
    5.2.2 培养基和试剂  58-59
    5.2.3 实验方法  59-60
  5.3 实验结果与讨论  60-63
    5.3.1 抗菌脂肽对敏感酵母白色假丝酵母菌细胞原生质体的抑菌活性影响的实验结果  60-61
    5.3.2 电镜检测抗菌脂肽作用的敏感酵母 C. albicans 细胞  61
    5.3.3 荧光染色实验结果  61-63
  5.4 本章小结  63-65
论文的总结与创新点  65-67
参考文献  67-73
附录：英文缩写符号及其中英文名称  73-75
致谢  75-76
硕士期间发表的学术论文  76-77

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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