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Fengycin对Rhizopus stolonifer作用机理研究

作 者: 唐群勇
导 师: 别小妹
学 校: 南京农业大学
专 业: 发酵工程
关键词: Bacillus subtilis fmbJ fengycin Rhizopus stolonifer 抑菌机理
分类号: TS201.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


芽孢杆菌能产生多种抗菌物质,其中大部分是多肽,主要抑制革兰氏阳性茵;有些多肽还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母菌。由于Bacillus subtilis抗菌物质抑菌谱广、抗茵效果强,因此在农业、医学和轻工等领域具有重要应用价值。本实验室分离到一株可产生抗微生物脂肽fengycin的枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis fmbJ,前期研究表明该fengycin对丝状真菌Rhizopus stolonifer具有显著的抑菌活性。Rhizopus stolonifer是果蔬采收后的主要病原菌,在桃果贮藏、运输和销售中,常常引起果实腐烂损失。控制果蔬采后病害的传统的手段是使用化学杀菌剂,由于化学杀菌剂在果蔬中的残留毒性对人类健康有潜在危险,因此,利用微生物抗菌肽进行生物防治方面具有广阔的应用前景。目前,大量关于抗真菌机制的研究主要集中在两方面:(1)攻膜作用,在脂膜上形成孔洞,使重要的内容物外泄;(2)阻止、破坏真菌细胞壁的合成。为了更全面、深入的了解抗真菌肽的作用机制,本文主要从fengycin对Rhizopus stolonifer的呼吸链、营养物质利用及细胞凋亡三方面展开研究,得到以下研究结果:1.阐述了fengycin对Rhizopus stolonifer呼吸代谢和线粒体电子传递链的影响。通过对Rhizopus stolonifer呼吸速率测定发现,fengycin主要抑制Rhizopus stolonifer呼吸代谢的HMP途径;对Rhizopus stolonifer线粒体电子传递链上关键酶的活性进行研究,结果显示,随着fengycin浓度的增大,体内和体外作用都使琥珀酸脱氢酶活性呈现先降后升的现象。随着fengycin浓度的升高,体外作用时,NADH脱氢酶活性变化不大;体内作用时,NADH脱氢酶活性呈下降趋势。说明fengycin不能与NADH脱氢酶相结合而抑制其活性,而是抑制Rhizopus stolonifer电子传递链上NADH脱氢酶相关基因的表达,降低其活性。因此,fengycin能使Rhizopus stolonifer电子传递受阻,导致其能量合成受到抑制,影响生长。2.确定了fengycin对Rhizopus stolonifer营养物质利用的影响,结果发现fengycin使Rhizopus stolonifer对营养物质的利用减少;SDS-PAGE电泳结果表明,fengycin处理后,使Rhizopus stolonifer的蛋白质合成异常;对Rhizopus stolonifer菌体中糖和蛋白质含量测定,结果显示随着fengycin浓度的升高,Rhizopus stolonifer体内还原糖含量呈下降趋势,总糖和蛋白质含量呈上升趋势。并且,与空白对照相比,总糖和蛋白质含量均显著升高。表明Rhizopus stolonifer体内物质的分解代谢受到抑制。3.阐明了fengycin能够诱导Rhizopus stolonifer细胞发生凋亡作用。通过电镜对Rhizopus stolonifer的超微结构观察发现:fengycin使Rhizopus stolonifer核染色质浓缩聚集,菌丝体起泡变圆,活性氧(ROS)积累,线粒体膜电位下降,细胞膜磷脂酰丝氨酸呈现外翻现象,基因组DNA片段化,说明Rhizopus stolonifer出现细胞凋亡。此外Annexin V染色和TUNEL检测实验结果表明:fengycin浓度较低时(<50μg/ml),使Rhizopus stolonifer细胞发生凋亡;fengycin浓度较高时(>50μg/ml),使Rhizopus stolonifer细胞死亡。

全文目录


摘要  9-11ABSTRACT  11-14第一章 文献综述  14-28  1 抗菌肽的特点  15-16  2 抗菌肽的作用机制  16-19    2.1 抑制细胞壁的形成  17    2.2 对细胞膜的作用  17-18    2.3 抑制细胞呼吸  18    2.4 抑制胞外或胞内膜蛋白的形成  18    2.5 破坏细胞DNA  18-19    2.6 诱导细胞凋亡  19  3 抗菌肽的应用前景  19-21    3.1 在农业上应用  20    3.2 在畜牧业上的应用  20    3.3 在医药上的应用  20    3.4 在食品上的应用  20-21  4 本研究的目的和意义  21-22  参考文献  22-28第二章 Fengycin对Rhizopus stolonifer呼吸代谢的影响  28-40  1 材料与方法  28-32    1.1 材料  28-30    1.2 方法  30-32  2 结果与分析  32-35    2.1 Fengycin对Rhizopus stolonifer呼吸代谢的影响  32-33    2.2 Fengycin对Rhizopus stolonifer NADH脱氢酶活性的影响  33-34    2.3 Fengycin对Rhizopus stolonifer琥珀酸脱氢酶活性的影响  34-35  3 讨论  35-36  4 本章小结  36-37  参考文献  37-40第三章 Fengycin对Rhizopus stolonifer营养物质利用的影响  40-50  1 材料与方法  40-43    1.1 材料  40-41    1.2 方法  41-43  2 结果与分析  43-47    2.1 Fengycin对Rhizopus stolonifer营养物质利用的影响  43-44    2.2 Fengycin对Rhizopus stolonifer糖含量的影响  44-45    2.3 Fengycin对Rhizopus stolonifer蛋白质含量的影响  45-46    2.4 Fengycin对Rhizopus stolonifer蛋白质合成的影响  46-47  3 讨论  47  4 本章小结  47-48  参考文献  48-50第四章 Fengycin对Rhizopus stolonifer细胞凋亡的影响  50-62  1 材料方法  51-53    1.1 材料  51-52    1.2 方法  52-53  2 结果与分析  53-59    2.1 Hoechst 33258染色  53-54    2.2 Fengycin对Rhizopus stolonifer ROS积累的影响  54-55    2.3 Fengycin对Rhizopus stolonifer线粒体膜电位的影响  55-56    2.4 Fengycin对Rhizopus stolonifer PS外翻的影响  56-58    2.5 TUNEL检测  58-59  3 讨论  59-60  4 本章小结  60  参考文献  60-62全文结论  62-64创新点  64-66研究生期间发表的研究论文  66-68致谢  68

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品微生物学
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