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产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选及酶学特性研究

作 者: 赵丹丹
导 师: 张建新
学 校: 河南师范大学
专 业: 微生物学
关键词: 内生菌 β-甘露聚糖酶 酶学特性 发酵优化
分类号: TQ925
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


β-1,4-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannanmann-ohydrolase ,EC3.2.1.78),是一类能水解含β-l,4- D-甘露糖糖苷键的内切水解酶,属于半纤维素酶类。目前,国内外有关于筛选产β-甘露聚糖酶菌株的报道大多限于从土壤或水体中分离产的菌株。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来,植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注,有关于植物内生菌的研究最初主要集中于拮抗菌的筛选,近几年更关注于产生物活性物质菌株的分离,但在产酶菌株筛选方面国内外见相关报道很少,本研究尝试在内生菌中筛选产β-甘露聚糖酶的菌株。本研究采用富集培养的方法从富含甘露聚糖的植物组织中分离出46株内生菌菌株,利用刚果红染色法筛进行初筛,选出7株产β-甘露聚糖酶的内生菌菌株。采用摇瓶培养和测定其酶活力方法,复筛出2株产酶能力较高的菌株CH--3和HD-1,其酶活力分别达42 U/mL和54 U/mL,具有较高的研究价值。克隆并测定菌株CH-3的16S rDNA序列,采用BLAST软件在GeneBank进行16S rDNA序列同源性比较,发现CH-3的16S rDNA序列与类芽孢杆菌属细菌(Paenibacillus polymyxa strain YRL13 EU373421)相似度达97%。结合它的形态观察及生理生化试验,初步鉴定CH-3为类芽孢杆菌属细菌Paenibacillus sp(.Genbank登录号为HQ329105)。克隆菌株HD-1的16S rDNA序列进行测定并用采用BLAST软件在GeneBank进行16S rDNA序列同源性比较,发现HD-1的16S rDNA序列与芽孢杆属细菌(Bacillus subtilis EU257435)相似度高达99%。结合其形态观察及生理生化试验,初步鉴定HD-1为芽孢杆属细菌Bacillus sp.(Genbank登录号为HQ329104)。酶学性质的分析发现,菌株CH-3产生的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别为40℃和5.0-8.0之间;该酶在50℃保温2 h酶活仍保留63 %,pH 5. 0-10. 0条件下保温1 h酶活仍保留66 %以上; Fe2+、Ca2+、Co2+、对该酶有激活作用,其中以Co2+的激活作用最为显著,使酶活提高了23 %;Cu2+、Mn2+、Zn2 +和EDTA对该酶有抑制作用。菌株HD-1产生的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别为30℃-50℃和7.0;该酶在50℃保温2 h酶活仍保留68 %,pH 5. 0-9. 0条件下保温1 h酶活仍保留64 %以上, Zn2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、K+对该酶有激活作用,其中以Ca2+的激活作用最为显著,使酶活提高了31 %;Mn2+和EDTA对该酶有抑制作用。通过对发酵温度、培养基初始pH值的单因素试验和转速、发酵时间和接种量等的正交试验对HD-1产β-甘露聚糖酶的影响的研究,得到HD-1的最佳培养条件为:培养温度35℃,初始pH值7.0,200 r/min,发酵72 h,接种量为5 %。以摇瓶发酵培养基为基础,对碳源的种类和浓度、氮源的种类、氮源与碳源的比例进行的单因素优化,结果显示,以3%魔芋粉作为碳源,以0.375 % (NH4)2SO4作为氮源有利于HD-1产酶;对发酵培养基中的离子浓度进行正交试验优化,得到最优的离子浓度分别为FeSO4 0.001 %,NaCl 0.5 %,MgSO4 0.01 %。经过培养条件和培养基的优化,HD-1的产酶水平达到98.3 U/mL,约是复筛酶活力的1.8倍。采用优化后的发酵培养基配方和培养条件在50 L发酵罐中进行菌株HD-1产酶的放大试验,从发酵的8 h开始,每隔4 h取样测其酶活力。结果表明,从发酵培养的56 h开始酶活力迅速增加,在64 h达到高峰期,发酵液的最高酶活力达193.12 U/mL,约是菌株复筛酶活力的3.6倍,摇瓶发酵酶活力的2倍。表明采用发酵罐生产更有利于菌株HD-1产酶,这也为以后该菌株的工业化生产打下了基础。

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摘要  4-6ABSTRACT  6-11第一章 前言  11-25  1.1 甘露聚糖  11  1.2 β-甘露聚糖酶  11-19    1.2.1 β-甘露聚糖酶的来源及其性质  12-14    1.2.2 β-甘露聚糖酶的多样性  14-16    1.2.3 β-甘露聚糖酶的分离纯化及作用机理  16    1.2.4 β-甘露聚糖酶的应用  16-18    1.2.5 β-甘露聚糖酶的基因工程研究  18-19  1.3 植物内生菌  19-22    1.3.1 植物内生菌的多样性  20-21    1.3.2 植物内生菌的应用  21-22  1.4 本课题的研究意义和技术路线  22-25    1.4.1 本课题的研究意义  22    1.4.2 本课题的技术路线  22-25第二章 材料与方法  25-39  2.1 供试植物  25  2.2 供试菌株  25  2.3 培养基  25-26  2.4 酶与生化试剂  26  2.5 主要设备及仪器  26-27  2.6 主要试剂及配制  27-29  2.7 植物内生菌的分离  29    2.7.1 植物组织表面消毒  29    2.7.2 植物内生菌的分离  29  2.8 β-甘露聚糖酶菌株的筛选  29-31    2.8.1 产β-甘露聚糖酶菌株的初筛  29-30    2.8.2 产β-甘露聚糖酶菌株的复筛  30-31  2.9 产β-甘露聚糖酶菌株的鉴定  31-34    2.9.1 形态观察  31    2.9.2 生理生化特征测定  31-33    2.9.3 分子生物学鉴定  33-34  2.10 复筛菌株产β-甘露聚糖酶粗酶性质的测定  34-35    2.10.1 温度对酶活力的影响  34    2.10.2 温度对酶稳定性的影响  34    2.10.3 pH 值对酶活力的影响  34-35    2.10.4 pH 值对酶稳定性的影响  35    2.10.5 常见离子及EDTA 对酶活的影响  35  2.11 复筛菌株产酶培养条件的优化  35-36    2.11.1 温度对复筛菌株产酶的影响  35    2.11.2 初始pH 值对复筛菌株产酶的影响  35    2.11.3 转速、培养时间、接种量对复筛菌株产酶的影响  35-36  2.12 复筛菌株产酶培养基的优化  36-38    2.12.1 碳源种类对复筛菌株产酶的影响  36    2.12.2 碳源浓度对复筛菌株产酶的影响  36-37    2.12.3 氮源种类对复筛菌株产酶的影响  37    2.12.4 氮源与碳源比例对复筛菌株产酶的影响  37    2.12.5 离子的种类及浓度对复筛菌株产酶的影响  37-38  2.13 复筛菌株产β-甘露聚糖酶发酵罐扩大试验  38-39第三章 结果与分析  39-65  3.1 植物内生菌的分离  39-41  3.2 产β-甘露聚糖酶菌株的筛选  41-43    3.2.1 产β-甘露聚糖酶菌株的初筛  41-42    3.2.2 产β-甘露聚糖酶菌株的复筛  42-43  3.3 CH-3 和HD-1 和的菌株鉴定  43-50    3.3.1 CH-3 的菌株鉴定  43-46    3.3.2 HD-1 的菌株鉴定  46-50  3.4 CH-3 和HD-1 产β-甘露聚糖酶粗酶的酶学特性  50-56    3.4.1 CH-3 产β-甘露聚糖酶粗酶的酶学特性  50-53    3.4.2 HD-1 产β-甘露聚糖酶粗酶的酶学特性  53-56  3.5 HD-1 产酶培养条件的优化  56-59    3.5.1 温度对对HD-1 产酶的影响  56-57    3.5.2 初始pH 值对对HD-1 产酶的影响  57-58    3.5.3 转速、发酵时间、接种量对HD-1 产酶的影响  58-59  3.6 HD-1 产酶培养基的优化  59-63    3.6.1 碳源种类对HD-1 产酶的影响  59-60    3.6.2 碳源的浓度对HD-1 产酶的影响  60-61    3.6.3 氮源种类对HD-1 产酶的影响  61    3.6.4 氮源与碳源比例对HD_1 产酶的影响  61-62    3.6.5 离子种类及浓度对HD-1 产酶的影影响  62-63  3.7 HD-1 产β-甘露聚糖酶发酵罐放大试验  63-65结论  65-67参考文献  67-75致谢  75-76攻读学位期间发表的毕业论文目录  76-77

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂(酵素)
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