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Bacillus subtilis fmbJ抗菌脂肽对Rhizopus stolonifer作用机理研究

作　者: 陶阳
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 抗菌脂肽 桃软腐病菌 fengycin surfactin 抑菌机理
分类号: TS255.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


桃软腐病菌(Rhizopus stolonifer)是果蔬采收后的主要病原菌,常引起贮藏、运输和销售中的大量烂果,损失严重。由于长期使用杀虫剂,导致菌株产生抗药性。同时,随着人们对农药残留问题越来越关注,许多生产上常用的杀菌剂已被明令禁止使用。因此,寻求安全、无毒、经济、有效的控制采后果蔬腐烂的方法成为当务之急。Bacillus subtilis在生长代谢过程中能够产生不同种类的抗菌物质,由于Bacillus subtilis抗菌物质抑菌谱广、抗菌效果强,因此在农业、医学和轻工等领域具有广阔的应用前景。近几年来,本实验室筛选到一株食品源的Bacillus subtilis fmbJ,该菌株产生的抗微生物活性物质具有良好的热稳定性和部分酶稳定性,抗菌谱广,抗微生物活性高。前期研究表明该微生物活性物质主要为surfactin和fengycin,均为环状脂肽。目前关于脂肽对桃软腐病菌的作用机理尚未阐明,surfactin与fengycin在抑菌过程中的相互关系也未见报道。因此,本论文主要对该菌株产生的脂肽对桃软腐病菌的作用机理进行研究,同时从不同的角度研究surfactin与fengycin在抑菌过程中的相互关系,得到以下研究结果：1.对Bacillus subtilis fmbJ发酵产的脂肽进行ESI-MS/CID分析表明,在所设定的液相洗脱条件下,surfactin的出峰时间为17.5-24.5min, fengycin的出峰时间为24.5-32.2min。通过对发酵不同时间的脂肽提取物进行高效液相色谱分析和抑菌活性测定得出,发酵50小时时,脂肽的产量最高。此时样品中fengycin与surfactin的浓度比为5:1。2.F:S=5:1(浓度比)和F:S=1:1的两种脂肽组合对桃软腐病菌的菌丝生长、孢子萌发和产孢能力都具有抑制作用。F:S=5:1的脂肽组合对桃软腐病菌孢子的最小抑菌浓度(MIC)为fengycin 0.4mg/mL,最小致死浓度(MFC)为fengycin 1.4mg/mL,对菌丝的有效抑制中浓度(EC50)为fengycin 27.68ug/mL。F:S=1:1的脂肽组合对桃软腐病菌孢子的MIC为fengycin 2.0mg/mL, MFC为fengycin 6.5mg/mL,对菌丝的EC50为fengycin 98.12μg/mL。通过扫描电镜和透射电镜观察发现,两种脂肽组合作用后不但可引起菌丝表面形态的变化,还可穿过细胞膜,破坏细胞内部结构。比较两种脂肽组合的抑菌效果得出,surfactin可降低fengcyin对桃软腐病菌的抑制作用。3.通过检测细胞外紫外吸收物质蛋白质和核酸以及K+的泄露,结合PI染色得出,脂肽可改变桃软腐病菌细胞膜的通透性,破坏其完整性,导致细胞内物质泄露,引起细胞的快速死亡。31PNMR研究脂肽与模拟细胞膜的相互作用发现,脂肽可破坏细胞膜中磷酰基的结构。另外,surfactin可降低fengycin对磷酰基的破坏程度。4.通过紫外光谱扫描和凝胶阻滞试验可知,两种脂肽组合在细胞外无法与桃软腐病菌基因组DNA发生作用。运用流式细胞术和同位素标记技术研究发现,两种脂肽组合可改变桃软腐病菌的细胞周期,抑制DNA的复制。比较3H-TdR掺入量得出,surfactin可降低fengycin对桃软腐病菌DNA合成的抑制作用。

全文目录


表格索引  9-10图形索引  10-12摘要  12-14ABSTRACT  14-17第一章 文献综述  17-32  1 抗菌脂肽的研究进展  17-20    1.1 抗菌脂肽的产生菌株  17-18    1.2 抗菌脂肽的结构、特性及合成  18-20      1.2.1 表面活性素(surfactin)  19      1.2.2 芬荠素(fengycin)  19      1.2.3 伊枯草菌素(iturin)  19-20      1.2.4 其他种类的抗菌物质  20  2 抗菌肽作用机制的研究进展  20-23    2.1 抗菌肽的抗细菌作用机制  20-23      2.1.1 抗菌肽与细菌细胞壁的作用  20-21      2.1.2 抗菌肽与细菌细胞膜的作用  21-22      2.1.3 抗菌肽与细菌胞质内靶目标的作用  22-23    2.2 抗菌肽的抗肿瘤作用机制  23    2.3 抗菌肽的抗病毒作用机制  23    2.4 抗菌肽的作用机制研究方法  23  3 本研究的目的和意义  23-25  参考文献  25-32第二章 Bacillus subtilis fmbJ发酵产抗菌脂肽的动态研究  32-41  1 材料与方法  32-35    1.1 材料  32-33      1.1.1 菌种  32      1.1.2 培养基  32-33      1.1.3 主要仪器与设备  33      1.1.4 主要试剂  33    1.2 方法  33-35      1.2.1 Bacillus subtilis fmbJ菌种活化  33      1.2.2 Bacillus subtilis frnbJ种子液制备  33      1.2.3 Bacillus subtilis fmbJ产脂肽的发酵培养  33-34      1.2.4 Bacillus subtilis fmbJ产脂肽的分离纯化  34      1.2.5 Bacillus subtilis fmbJ产脂肽的高效液相色谱分析(HPLC)  34      1.2.6 Bacillus subtilis fmbJ产脂肽对桃软腐病菌的抑菌活性测定  34      1.2.7 Bacillus subtilis fmbJ产脂肽的ESI-MS/CID分析  34      1.2.8 Surfactin和fengycin的检测方法  34      1.2.9 不同发酵时间对Bacillus subtilis fmbJ产脂肽的影响  34-35  2 结果与讨论  35-39    2.1 Bacillus subtilis fmbJ产脂肽的ESI-MS/CID分析  35-38    2.2 不同发酵时间对Bacillus subtilis fmbJ产脂肽的影响  38-39  3 本章小结  39-40  参考文献  40-41第三章 Bacillus subtilis fmbJ抗菌脂肽对桃软腐病菌菌丝生长和孢子萌发的影响  41-55  1 材料与方法  42-45    1.1 材料  42-43      1.1.1 菌种  42      1.1.2 培养基  42      1.1.3 主要仪器与设备  42-43      1.1.4 主要试剂  43    1.2 方法  43-45      1.2.1 两种脂肽组合的制备  43      1.2.2 两种脂肽组合对桃软腐病菌孢子的最小抑制浓度(MIC)和最小致死浓度(MFC)的测定  43      1.2.3 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝生长的影响  43-44      1.2.4 两种脂肽组合对桃软腐病菌孢子萌发的影响  44      1.2.5 两种脂肽组合对桃软腐病菌产孢能力的影响  44      1.2.6 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝表面形态的影响及扫描电镜标本的制备  44-45      1.2.7 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝内部结构的影响及透射电镜标本的制备  45  2 结果与讨论  45-51    2.1 两种脂肽组合对桃软腐病菌孢子的最小抑制浓度(MIC)和最小致死浓度(MFC)的测定  45-46    2.2 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝生长的影响  46-47    2.3 两种脂肤组合对桃软腐病菌抱子萌发的影响  47-49    2.4 两种脂肤组合对桃软腐病菌产袍能力的影响  49    2.5 两种脂肤组合对桃软腐病菌菌丝显微特征的影响  49-51  3 本章小结  51-53  参考文献  53-55第四章 Bacillus subtilis fmbJ抗菌脂肽对桃软腐病菌细胞膜系统的影响  55-65  1 材料与方法  55-58    1.1 材料  55-56      1.1.1 菌种  55      1.1.2 培养基  55-56      1.1.3 主要仪器与设备  56      1.1.4 主要试剂  56    1.2 方法  56-58      1.2.1 两种脂肽组合的制备  56-57      1.2.2 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝蛋白质和核酸泄露的影响  57      1.2.3 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝K~+泄露的影响  57      1.2.4 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝细胞膜完整性的影响  57      1.2.5 两种脂肽组合与模拟细胞膜的相互作用  57-58  2 结果与讨论  58-63    2.1 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝蛋白质和核酸泄露的影响  58-59    2.2 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝K~+泄露的影响  59-60    2.3 两种脂肽组合对桃软腐病菌菌丝细胞膜完整性的影响  60-61    2.4 两种脂肽组合与模拟细胞膜的相互作用  61-63  3 本章小结  63-64  参考文献  64-65第五章 Bacillus subtilis fmbJ抗菌脂肽对桃软腐病菌遗传物质合成的影响  65-73  1 材料与方法  65-68    1.1 材料  65-66      1.1.1 菌种  65-66      1.1.2 培养基  66      1.1.3 主要仪器与设备  66      1.1.4 主要试剂  66    1.2 方法  66-68      1.2.1 两种脂肽组合的制备  66-67      1.2.2 桃软腐病菌基因组DNA的提取方法  67      1.2.3 两种脂肽组合与桃软腐病菌基因组DNA作用的紫外光谱扫描  67      1.2.4 两种脂肽组合与桃软腐病菌基因组DNA作用的凝胶阻滞试验  67      1.2.5 两种脂肽组合对桃软腐病菌细胞周期的影响  67-68      1.2.6 同位素前体掺入试验  68  2 结果与讨论  68-71    2.1 两种脂肽组合与桃软腐病菌基因组DNA作用的紫外光谱扫描  68-69    2.2 两种脂肽组合与桃软腐病菌基因组DNA作用的凝胶阻滞试验  69-70    2.3 两种脂肽组合对桃软腐病菌细胞周期的影响  70    2.4 同位素前体掺入试验  70-71  3 本章小结  71-72  参考文献  72-73全文结论  73-75创新点  75-77致谢  77

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 水果、蔬菜、坚果加工工业 > 基础科学
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