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枯草杆菌脂肽抗嗜水气单胞菌的机理和应用研究

作　者: 杨丽莉
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 脂肽嗜水气单胞菌抑菌机制免疫抗氧化
分类号: S948
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目前水产养殖病害损失比例中鱼类占很大部分,主要以细菌性疾病为主,并且大多数是由嗜水气单胞菌引起的鱼类细菌性出血病。在生产上经常用抗生素类药物作为饲料添加剂,来达到预防和治疗的目的。但是微生物的耐药性问题一直困扰着世界的养殖业,并且抗生素的残留也给人类的健康带来潜在威胁,所以迫切需要寻找一种新的产品来替代抗生素。由于抗菌肽既有广谱抗菌性,不会诱导抗药菌株的产生,不会产生耐药性,所以它有望成为抗生素的替代品。本试验室保存的一株枯草杆菌fmbJ产生的抗菌物质主要为环状脂肽,该脂肽具有良好的热稳定性和部分酶稳定性,抗微生物活性较高,可能成为一种绿色饲料添加剂。本论文主要通过枯草杆菌脂肽对嗜水气单胞菌菌体细胞作用,来探讨其抑菌机理；同时对脂肽产品工艺化条件进行研究；并将脂肽作为饲料添加剂,测定鱼体的生长、免疫和抗氧化性等指标,以此确定脂肽做为饲料添加剂的可行性。主要研究结果如下：1.研究了脂肽抑制嗜水气单胞菌的敏感性及作用效果。结果表明,嗜水气单胞菌对其具有较高的敏感性,最小抑菌浓度为20μg/mL,最小杀菌浓度为32μg/mL；测定嗜水气单胞菌生长曲线,通过脂肽作用菌体生长不同时期的变化,得到其抑菌和杀菌的效果；通过钾离子试验、碘化丙锭染色、细胞内大分子泄露试验,测定脂肽对嗜水气单胞菌菌体细胞细胞膜的通透性；通过电镜试验观察到脂肽导致嗜水气单胞菌细胞壁缺失、鞭毛散失、胞内物质模糊不清等现象。2.研究了脂肽对嗜水气单胞菌细胞内基因组DNA和蛋白质的作用。结果表明,脂肽能和嗜水气单胞菌染色体DNA结合,导致DNA最大吸收峰的改变并产生增色效应。同时脂肽能够对嗜水气单胞菌合成的胞外蛋白酶有一定影响,而此种胞外蛋白酶是嗜水气单胞菌的主要毒力因子。3.研究了脂肽产品制备工艺的条件,通过添加赋形剂,在不同的进风温度,不同的风速,不同的蠕动泵的速度下,根据正交实验优化脂肽的产品回收率。结果表明,在蠕动泵的速度50 ml/h,进风温度210℃,风速70 M3/h,回收率最高,达到75%。4.研究了在异育银鲫的基础日粮中添加不同量的脂肽产品以后异育银鲫的生长,肠道菌群的变化,免疫以及抗氧化性等的影响。结果表明,添加脂肽以后异育银鲫无论是生长方面,还是肠道菌群的变化,以及免疫和抗氧化能力都优于对照组。添加4%。脂肽时,异育银鲫鱼的增重率在第8周的时候显著提高(p<0.05)；肝体显著提高(P<0.05)；肠道菌群中有害菌降低；免疫力和抗氧化性能都显著提高(p<0.05)

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一章文献综述 11-27 前言 11-12 1 鱼类的免疫机制 12-14 1.1 免疫器官和组织 12 1.2 鱼类的免疫细胞 12-13 1.3 鱼类体液免疫及其相关因子 13-14 1.3.1 溶菌酶(lysozyme) 13 1.3.2 干扰素(interferon,INF) 13 1.3.3 免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig) 13-14 1.3.4 补体(complemem) 14 2 抗菌肽的研究概况 14-17 2.1 抗菌肽的发现与发展 14-15 2.2 抗菌肽的作用机制及特点 15-16 2.2.1 抗菌肽对细菌和真菌的作用 15 2.2.2 抗菌肽对病毒的作用 15 2.2.3 抗菌肽对肿瘤细胞的作用 15-16 2.2.4 作用部位的有效性 16 2.2.5 作用对象的选择性 16 2.3 抗菌肽的应用范围 16-17 3 国内外饲料添加剂发展现状 17-19 3.1 饲料添加剂的概况 17 3.2 新型饲料添加剂分类 17-18 3.3 新型饲料添加剂功效 18-19 4 抗菌肽在饲料工业中的应用 19-21 4.1 抗菌肽作为饲料添加剂的优势 19-20 4.2 抗菌肽作为饲料添加剂应用存在的问题 20-21 4.3 抗菌肽作为饲料添加剂的展望 21 5. 本研究的主要内容 21-22 参考文献 22-27第二章枯草杆菌脂肽对嗜水气单胞菌细胞的影响 27-42 1 材料与方法 27-31 1.1 实验菌株 27 1.2 主要试剂 27 1.3 仪器设备 27-28 1.4 培养基 28 1.5 枯草芽孢杆菌产脂肽的制备以及含量测定 28-29 1.5.1 菌种活化 28 1.5.2 种子液培养 28-29 1.5.3 发酵液的制备 29 1.5.4 分离纯化 29 1.6 枯草芽孢杆菌产生的脂肽对嗜水气单胞菌细胞的作用 29-31 1.6.1 脂肽的敏感性测试 29-30 1.6.2 脂肽对嗜水气单胞菌生长曲线的影响 30 1.6.3 脂肽对嗜水气单胞菌细胞膜通透性的影响 30 1.6.4 脂肽对嗜水气单胞菌显微特征的影响 30-31 2 结果与讨论 31-38 2.1 脂肽敏感性测试 31-32 2.2 脂肽对嗜水气单胞菌生长曲线的影响 32-33 2.3 脂肽对嗜水气单胞菌细胞膜通透性的影响 33-37 2.4 脂肽对嗜水气单胞菌细胞的显微结构的影响 37-38 3 小结 38-40 参考文献 40-42第三章枯草杆菌脂肽对嗜水气单胞菌细胞内物质的影响 42-50 1 材料与方法 42-44 1.1 指示菌株 42-43 1.2 主要试剂 43 1.3 主要仪器 43 1.4 培养基 43-44 1.5 与DNA的相互作用 44 1.6 对胞外产物合成的影响 44 2 结果与讨论 44-47 2.1 与嗜水气单胞菌染色体基因组DNA的相互作用 44-45 2.2 对嗜水气单胞菌菌体产生的胞外酶的作用 45-47 3. 小结 47-48 参考文献 48-50第四章脂肽产品制备工艺的研究 50-58 1 材料与方法 50-53 1.1 实验菌株 50 1.2 仪器设备 50 1.3 培养基 50-51 1.4 产品的制备 51 1.4.1 发酵产物的制备 51 1.4.2 脂肽产品的制备 51 1.5 单因素对脂肽回收率的影响 51-52 1.6 脂肽回收率的优化 52 1.7 脂肽产品效价的测定 52-53 2. 结果与讨论 53-56 2.1 单因素试验 53-55 2.1.1 不同温度对回收率的影响 53 2.1.2 不同风速对回收率的影响 53-54 2.1.3 不同蠕动泵速度对回收率的影响 54-55 2.2 脂肽回收率的优化 55-56 2.3 脂肽产品的效价 56 3 小结 56-57 参考文献 57-58第五章脂肽对银鲫的生长和免疫及抗氧化的影响 58-71 1 材料与方法 58-61 1.1 试验银鲫 58 1.2 饲养试验 58-59 1.3 培养基 59-60 1.4 样品采集相关指标计算公式和肠道微生物的测定 60 1.5 免疫指标测定和抗氧化指标测定 60-61 1.6 数据统计与分析 61 2 结果与讨论 61-67 2.1 脂肽对银鲫生长的影响 61-62 2.2 脂肽对银鲫肠道菌群的影响 62-64 2.3 脂肽对银鲫免疫和抗氧化指标的影响 64-67 2.3.1 脂肽对银鲫血清溶菌酶和一氧化氮含量的影响 64-65 2.3.2 脂肽对银鲫血清抗氧化指标的影响 65-67 3 小结 67-68 参考文献 68-71全文结论 71-73致谢 73

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