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黄河三角洲滨海湿地放线菌多样性及活性潜力评估

作　者: 冯鸽
导　师: 李静
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物学
关键词: 黄河三角洲湿地放线菌非培养纯培养多样性功能基因抑菌活性
分类号: Q938.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

黄河三角洲地处中国暖温带，自然资源和生物资源丰富。但同时，由于淡水水源供给不足，加上海陆的共同作用，导致水盐的平衡失调，土壤盐碱化程度加重。该湿地的放线菌为了适应盐碱环境，可能存在独特的适应模式以及分子调节机制，很有可能会产生结构新颖的次级代谢产物。因此，研究黄河三角洲滨海湿地放线菌多样性对于放线菌资源的开发和持续利用具有重大的理论及实践意义。采用非培养技术分析了黄河滨海湿地环境中放线菌的多样性，对来自黄河三角洲滨海湿地四个位点的土壤样品构建16S rDNA克隆文库。16S rDNA序列的测序结果表明，位点BZ10的放线菌类群最多，分布于15个属中；位点DY14次之，包括12个放线菌属；位点DY40得到9个放线菌属；位点BZ25获得的放线菌类群最少，仅得到3个不同属。综合四个位点分析，黄河三角洲滨海湿地存在丰富的放线菌多样性，主要分布于放线菌纲（Actinobacteria）和酸微菌纲（Acidimicrobiia）的9个亚目中，分属于10个科，共包括了22个属。还有一些不能确定分类地位的类群，有可能代表新的放线菌类群。采用常规培养方法对包括上述四个位点在内的10个位点的样品进行了放线菌分离培养，分别采用高氏一号、改良淀粉酪素、ISP5、甘油-精氨酸、GW1、丙酸钠、M3和改良高氏一号共8种培养基，以制霉菌素、萘啶酮酸钠和重铬酸钾作为抑制剂，共分离得到165株放线菌。通过表观形态排重可分属于8个类群：白孢类群、黄色类群、粉红孢类群、粉红紫类群、青色类群、烬灰类群、灰褐类群、金色类群。每种类群中挑选形态不同的菌株（每种形态挑选2株）进行16SrDNA测序，结果表明，分离得到的菌株共分布于12个属，主要为Streptomyces属和Nocardiopsis属，还有一些稀有菌属，其中包括1株Agromyces属潜在新种。与非培养获得的放线菌多样性信息相比较发现，两种技术获得的放线菌多样性信息差异较大，由于分离培养技术的限制，环境中大多数的放线菌目前还不能被分离培养，非培养获得的放线菌多样性远多于纯培养获得菌株类群。对分离菌株合成活性次级代谢物的潜力进行了考察。分别采用K1F/M6R、FW/RV和A3F/A7R三对兼并引物进行I型聚酮合酶（PKS-I）、II型聚酮合酶（PKS-II）和非核糖体肽合成酶（NRPS）功能基因的筛选。其中，有9株放线菌含有I型聚酮合酶基因，有11株放线菌含有II型聚酮合酶基因，有6株菌含有非核糖体肽合成酶基因。部分菌株功能基因的氨基酸序列与GenBank已知化合物基因序列的最大同源性较低，预示具有合成结构新颖的化合物的潜力。挑选具有代表性的分离菌株进行抑菌活性的初步探索。采用的方法为琼脂块扩散法，选择了9株指示菌：鳗弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、白色假丝酵母菌、铜绿假单胞菌、鲍曼氏不动杆菌（编号11927）、鲍曼氏不动杆菌（编号11910）、MRSA（甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌）、MRCNS（甲氧苯青霉素抗性凝固酶阴性葡萄球菌）。共得到22株能够产生抑菌圈的菌株，包括9株链霉菌、8株拟诺卡氏菌和5株芽孢杆菌。除了白色假丝酵母菌和铜绿假单胞菌外，其他的指示菌都能被分离得到的某些菌株抑制，而产生大小不等的抑菌圈，其中菌株OAct388表现出的抑菌效果最好，对6株指示菌有抑制作用；菌株OAct363对5株指示菌具有抑菌作用。本论文的研究结果表明，黄河三角洲滨海湿地蕴藏着丰富的放线菌资源，分离得到的很多菌株为I型聚酮合酶、II型聚酮合酶或非核糖体肽合成酶的潜在生产菌株，同时，抑菌活性实验也显示出很多菌株具有良好的抑菌活性。非培养技术与可培养技术的结合，极大地提高了微生物多样性分析的可靠性，功能基因筛选技术对放线菌活性次级代谢产物的分离具有重要的指导意义。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章文献综述  13-25
  1 黄河三角洲滨海湿地概况  13-14
  2 放线菌  14-18
    2.1 放线菌概述  14-15
    2.2 极端环境和特殊生境放线菌研究进展  15-17
    2.3 放线菌的分离研究  17-18
  3 分子生物学技术在微生物多样性分析的应用  18-20
    3.1 16S rDNA 文库分析法  18-19
    3.2 荧光原位杂交技术（FISH）  19
    3.3 变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）  19
    3.4 限制性片段的长度多态性（RFLP）  19-20
    3.5 扩增片段长度多态性分析（AFLP）  20
    3.6 末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）  20
  4 功能基因研究现状  20-24
    4.1 聚酮合成酶（PKS）基因研究现状  21-23
    4.2 非核糖体肽合成酶（NRPS）基因研究现状  23-24
  5 本论文研究的目的及意义  24-25
第二章非培养技术分析黄河三角洲滨海湿地放线菌多样性  25-47
  1 实验材料  25-27
    1.1 土壤样品  25
    1.2 主要试剂和仪器  25-27
  2 实验方法  27-33
    2.1 土壤样品部分理化性质的测定  27-28
    2.2 基因克隆文库的建立  28-31
    2.3 16S rDNA 序列的克隆测序  31-32
    2.4 16S rDNA 文库的系统发育分析及多样性分析  32-33
  3 结果与分析  33-46
    3.1 样品的采集  33
    3.2 土壤样品可溶性总盐及 pH 的测定  33-34
    3.3 样品 DNA 的提取及纯化  34-35
    3.4 纯化产物的 PCR 扩增  35
    3.5 放线菌 16S rDNA 基因克隆文库的构建及 RFLP 分析  35-36
    3.6 16S rDNA 基因文库多样性指数分析  36-37
    3.7 16S rDNA 基因序列的多样性及系统发育分析  37-46
  4 本章小结  46-47
第三章纯培养技术分析黄河三角洲滨海湿地放线菌多样性  47-63
  1 实验材料  47-50
    1.1 样品  47
    1.2 主要试剂和仪器  47-48
    1.3 培养基  48-50
    1.4 引物  50
  2 实验方法  50-52
    2.1 放线菌分离培养  50
    2.2 放线菌的纯化及保藏  50-51
    2.3 放线菌菌株基因组 DNA 提取  51
    2.4 放线菌菌株 16S rDNA 的基因扩增  51-52
    2.5 PCR 产物回收  52
    2.6 胶回收产物连接及转化  52
    2.7 阳性克隆的验证  52
  3 结果与分析  52-62
    3.1 滨海湿地放线菌菌株的分离  52-57
    3.2 滨海湿地放线菌菌株基因组 DNA 的提取  57
    3.3 滨海湿地放线菌菌株 16S rDNA 的基因扩增  57-58
    3.4 黄河滨海湿地放线菌多样性及 16S rDNA 系统发育分析  58-61
    3.5 非培养放线菌多样性与纯培养分离结果比较  61-62
  4 本章小结  62-63
第四章黄河三角洲滨海湿地纯培养放线菌的活性潜力评估  63-79
  1 实验材料  63-65
    1.1 样品  63
    1.2 主要试剂和仪器  63-64
    1.3 培养基  64
    1.4 功能基因扩增的引物  64-65
    1.5 供试致病菌株  65
  2 实验方法  65-67
    2.1 分离菌株生物学特性的初步探究  65
    2.2 分离菌株的抑菌活性实验  65-66
    2.3 功能基因的扩增  66-67
    2.4 目的基因片段的回收  67
    2.5 回收基因片段的连接、转化  67
    2.6 阳性克隆的验证  67
  3 结果与分析  67-77
    3.1 PKS-I、PKS-II 和 NRPS 基因的扩增结果及分析  67-74
    3.2 分离菌株生物学特性的初步探究  74
    3.3 分离菌株抑菌活性实验结果与分析  74-77
  4 本章小结  77-79
论文总结  79-81
研究展望  81-82
参考文献  82-86
致谢  86-87
发表的学术论文  87-88

黄河三角洲滨海湿地放线菌多样性及活性潜力评估

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