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烟碱降解菌株ND1的分离鉴定及其发酵体系研究

作　者: 彭可为
导　师: 戴良英
学　校: 湖南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 烟碱降解内生细菌种群多样性发酵
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

烟碱,学名尼古丁(nicotine),是烟草中最主要的生物碱,占其生物碱总量的95%以上。烟碱由根系合成,经导管运输至叶片贮存于液泡内,可协助烟草应对外界生物或非生物因素的胁迫。换言之,外界不适宜的气候条件和环境条件,以及病虫害入侵、机械损伤和肥水管理不当等,均可诱使烟碱合成并累积,最终导致烟碱含量上升。烟碱属杂环化合物,很难被大多数微生物降解利用。由烟草制品及其废弃物产生的烟碱可能在环境中逐渐累积,并通过“土壤-植物-人体”或“土壤-水-人体”等途径对人体健康和环境安全造成危害。湖南省是烟草种植和加工大省,常年种植面积稳定在145万亩以上。湖南省每年7-8月份的极端高温对烟草的正常成熟不利,易产生高温逼熟现象,并直接导致上部烟叶烟碱含量偏高,烟叶的等级下降,影响烟农的经济效益。本论文针对此现象,以长沙和郴州两地上部烟叶为材料,先富集培养分离其中的内生细菌,再利用烟碱作为唯一碳源和氮源进行筛选,获得可降解烟碱的内生细菌。并对内生细菌降解烟碱的能力进行比较分析,研究结果如下：1.从长沙和郴州两地烟田中,选取烟草品种K326的上部叶(心叶下4-5片),表面消毒后先富集培养分离其中的可培养内生细菌,再以烟碱为选择压(唯一碳源和氮源)筛选可降解烟碱的菌株。从取自长沙湖南农业大学基地和郴州的烟叶中分别分离到419个和458个可培养内生细菌,在筛选培养基上能够生长的菌株各109个和120个。通过外表形态特征分类后,从中各选取40个和42个菌株进行基于16S rDNA的系统进化分析,结果表明,Pseudomonas(假单胞杆菌属)是其中的优势菌群,占总数的48.6%,其次是Stenotrophomonas(寡养单胞菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)、Erwinia(欧氏杆菌属)、Cupriavidus(贪铜菌属)、Enterbacter(肠杆菌属)和Mangrovibacter sp.,各占26.4%、15%、2.5%、2.5%、2.5%和2.5%；两地烟叶中可培养内生细菌的种群多样性无显著差异。2.通过比较分析单位时间内烟碱降解率与细菌生长量,明确了80个菌株的烟碱降解能力。结果表明,分离自长沙烟叶中的内生细菌有7个菌株降解烟碱的效率达到76%以上,而分离自郴州烟叶中的内生细菌有11个菌株的烟碱降解效率达到76%以上,分别占可降解烟碱菌株数的20.59%和33.33%。其中降解能力最强的菌株为ND1,可在24h内将培养基中的烟碱(0.5g/L)降解82.6%。综合16S rDNA和BIOLOG方法鉴定,该菌株为荧光单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens).3.通过单因子实验,对菌株ND1的发酵条件进行初步优化,结果表明,接种量6%,30℃、摇床转速130r/min、pH6.0-7.0的情况下,ND1降解烟碱(0.5g/L)的速度最快,降解率最高；正交试验结果表明,当烟碱浓度为3.0g/L时,添加0.03%的玉米淀粉后,ND1可在72h内将烟碱降解98.85%。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章文献综述  10-24
  1.1 烟碱  10-13
    1.1.1 烟碱的物理化学性质  10-11
    1.1.2 烟碱对健康的危害  11-12
    1.1.3 烟碱对环境安全的潜在风险  12
    1.1.4 烟碱对烟草品质的不良影响  12-13
    1.1.5 烟碱在生物医药领域的用途  13
  1.2 烟碱的生物合成  13-15
    1.2.1 烟碱合成的分子机理  13-15
    1.2.2 影响烟碱生物合成的因素  15
  1.3 降低烟碱的措施  15-22
    1.3.1 农业技术手段  15-16
    1.3.2 化学手段降低烟碱含量  16-17
    1.3.3 微生物或酶降烟碱  17-22
  1.4 烟碱的微生物降解研究现状与应用发展前景  22-23
  1.5 研究目的  23-24
第二章烟碱降解细菌的分离与种群多样性分析  24-32
  2.1 材料与方法  24-27
    2.1.1 试验材料  24-25
    2.1.2 试验仪器  25
    2.1.3 实验方法  25-27
  2.2 结果与分析  27-30
    2.2.1 内生细菌的分离与纯化  27-28
    2.2.2 PCR扩增与特异性评价  28-29
    2.2.3 多样性分析及比较  29-30
  2.3 讨论  30-32
第三章内生细菌降解烟碱能力分析与优势菌株ND1的鉴定  32-39
  3.1 材料与方法  33-34
    3.1.1 内生细菌菌株由本论文分离并保存  33
    3.1.2 试剂BIOLOG GN平板购自BIOLOG公司  33
    3.1.3 实验仪器  33
    3.1.4 试验方法  33-34
  3.2 结果与分析  34-37
    3.2.1 内生细菌降解烟碱能力比较  34-35
    3.2.2 ND1的系统进化分析  35-36
    3.2.3 ND1的BIOLOG鉴定  36-37
  3.3 讨论  37-39
第四章 ND1(Pseudomonas fluorescens)降解烟碱特性研究  39-47
  4.1 材料与方法  39-41
    4.1.1 实验材料  39-40
    4.1.2 发酵体系正交实验  40-41
  4.2 结果与分析  41-45
    4.2.1 单因子实验  41-44
    4.2.2 ND1发酵体系的正交试验优化  44-45
  4.3 讨论  45-47
第五章总结  47-49
参考文献  49-57
致谢  57-58
作者简历  58

烟碱降解菌株ND1的分离鉴定及其发酵体系研究

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