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β-甘露聚糖酶基因工程菌的构建及高密度发酵研究

作　者: 郑甲
导　师: 周洪波
学　校: 中南大学
专　业: 微生物学
关键词: β-甘露聚糖酶毕赤酵母基因工程高密度发酵
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

β-甘露聚糖酶是一类半纤维素酶类,可水解甘露聚糖为甘露低聚糖,被广泛应用于造纸、食品、纺织、饲料和石油开采等领域,因而成为近年来研究的热点。本论文主要研究了来源于黑曲霉的p-甘露聚糖酶基因的优化合成、在毕赤酵母中表达、酶学性质检测及重组菌株的高密度发酵研究。主要内容包括以下方面：(1)p-甘露聚糖酶基因优化合成及拼接。考虑毕赤酵母密码子偏爱性、GC含量及mRNA二级结构的稳定性等因素对β-甘露聚糖酶基因序列进行优化；优化后基因序列被切割成54个相互重叠的短寡核苷酸片段,采用双重不对称PCR和重叠延伸PCR(?)将其连接成全长基因。(2)p-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达、纯化及酶学性质研究。优化合成的p-甘露聚糖酶基因被连接到pGAPZaA表达载体a-factor的下游,构建组成型表达载体pGAPZα-man。重组表达载体经Bgl Ⅱ线性化后电击转化毕赤酵母菌株X-33,涂布于含不同Zeocin浓度的YPDS平板上,挑取长出的重组子用YPD培养基进行摇瓶培养。SDS-PAGE显示发酵液呈现出三条单一条带,均大于理论分子量(35.7kDa)。纯化获得主要表达产物条带蛋白,其最适温度为45℃,最适pH为5.0,在0℃仍有20%以上的酶活；该酶具有较好高温耐受性,在90℃处理5min仍有50%以上的酶活。经去糖基化酶Endo H处理后,SDS-PAGE显示该酶大小与理论分子量大小一致,但其热耐受性消失。此实验表明,该基因在毕赤酵母中表达出现了高度的糖基化,糖基化使该酶具有一定的耐热性。(3)高酶活表达菌株及遗传稳定性菌株的筛选。建立并优化了DNS法测定p-甘露聚糖酶酶活的微量方法,探索出一种基于微量法测量酶活的筛选策略。从643株重组子中筛选获得数十株高表达菌株,并对其进行440h连续传代培养以检测其遗传稳定性,最终获得一株酶活表达水平高、遗传稳定性好的重组菌株Man68。(4)重组菌株的摇瓶水平发酵优化以及高密度发酵研究。通过研究不同的氮源(豆饼粉、花生饼粉、鱼粉和棉籽饼粉)对摇瓶发酵水平酶活的影响,确定了工业应用中可替代酵母粉和蛋白胨的氮源棉籽饼粉,经优化后摇瓶水平发酵酶活达到470U/mL；基于摇瓶发酵研究结果,进行高密度发酵研究,确定了流加调控策略。在5L发酵罐中流加培养60h后菌体湿重达302g/L,酶活达到2200U/mL:在50L发酵中,连续流加培养56h后细胞湿重达到566g/L,发酵酶活达到5069U/mL。该酶具有较宽的作用温度和pH范围,较好的耐热性以及较高的发酵酶活,使其在食品、动物饲料和生物燃料方面具有较好的应用前景。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩略词表  8-12
第一章绪论  12-18
  1.0 引言  12
  1.1 β-甘露聚糖酶  12
  1.2 毕赤酵母表达体系  12-14
    1.2.1 表达宿主  13
    1.2.2 表达载体  13-14
    1.2.3 外源基因在毕赤酵母中的重组和整合  14
    1.2.4 外源基因的在毕赤酵母中的表达  14
  1.3 毕赤酵母的高密度发酵  14-16
  1.4 β-甘露聚糖酶的热稳定性  16
  1.5 本文立题依据及主要工作  16-18
    1.5.1 研究目的和意义  16-17
    1.5.2 研究内容  17
    1.5.3 课题资助  17-18
第二章 β-甘露聚糖酶基因序列分析、优化、合成及毕赤酵母基因工程菌的构建  18-30
  2.1 引言  18
  2.2 实验材料与方法  18-22
    2.2.1 仪器材料  18
    2.2.2 实验方法  18-22
  2.3 实验结果  22-29
    2.3.1 β-甘露聚糖酶氨基酸序列分析  22-25
    2.3.2 β-甘露聚糖酶基因序列优化  25-26
    2.3.3 β-甘露聚糖酶基因序列合成与拼接  26-27
    2.3.4 β-甘露聚糖酶表达载体的构建和鉴定  27-29
    2.3.5 β-甘露聚糖酶基因在酵母中的整合和表达  29
  2.4 讨论  29-30
第三章 β-甘露聚糖酶毕赤酵母重组菌株的筛选  30-43
  3.1 引言  30
  3.2 实验材料与方法  30-33
    3.2.1 仪器材料  30-31
    3.2.2 实验方法  31-33
  3.3 实验结果  33-40
    3.3.1 微量法测定还原糖测量  33-36
    3.3.2 微量法测量β-甘露聚糖酶方法的优化  36-37
    3.3.3 β-甘露聚糖酶毕赤酵母重组菌株的筛选策略  37-38
    3.3.4 β-甘露聚糖酶毕赤酵母重组菌株的筛选策略的评估  38-39
    3.3.5 β-甘露聚糖酶毕赤酵母重组菌株的筛选结果  39-40
    3.3.6 β-甘露聚糖酶毕赤酵母重组菌株的遗传稳定性筛选结果  40
  3.4 讨论  40-43
第四章 β-甘露聚糖酶纯化、酶学性质及耐热性研究  43-52
  4.1 引言  43
  4.2 实验材料与方法  43-45
    4.2.1 仪器材料  43
    4.2.2 试验方法  43-45
  4.3 实验结果  45-49
    4.3.1 蛋白纯化  45-46
    4.3.2 温度对重组β-甘露聚糖酶的活力和稳定性的影响  46
    4.3.3 pH对重组β-甘露聚糖酶的活力和稳定性的影响  46-47
    4.3.4 糖基化对重组酶的耐热性的影响  47-48
    4.3.5 底物特异性分析及动力学参数  48-49
  4.4 讨论  49-52
第五章重组菌株的发酵条件研究  52-63
  5.1 引言  52
  5.2 实验材料与方法  52-55
    5.2.1 仪器材料  52-53
    5.2.2 实验方法  53-55
  5.3 实验结果  55-61
    5.3.1 摇瓶发酵  55-56
    5.3.2 摇瓶发酵优化结果  56-58
    5.3.3 5L发酵罐高密度发酵结果  58-60
    5.3.4 50L发酵罐高密度发酵结果  60-61
  5.4 讨论  61-63
第六章结论与建议  63-65
  6.1 本研究的主要结论  63
  6.2 本研究的创新点  63-64
  6.3 有待进一步研究的问题  64-65
参考文献  65-72
致谢  72-73
攻读学位期间主要的研究成果  73

β-甘露聚糖酶基因工程菌的构建及高密度发酵研究

内容摘要

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