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甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的表达及响应面法优化发酵培养基

作　者: 徐爱才
导　师: 刘军
学　校: 武汉工业学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: Monellin 基础盐培养基 毕赤酵母 响应面法
分类号: TQ926
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究利用毕赤酵母表达系统构建了高效胞内表达甜蛋白Monellin工程菌,采用响应面法对毕赤酵母发酵基础盐培养基进行了优化,并通过5L发酵罐培养比较工程菌在优化前后培养基中Monellin表达产量。1根据毕赤酵母密码子偏爱,人工合成了单链甜蛋白Monellin基因,并在基因的5’端加有碱基ACG后克隆到pUC18载体上。以载体pUC18-Mon为模板,PCR扩增了Monellin基因,并在上游引物引入BspT104I酶切位点,下游引物引入KpnI酶切位点,通过BspT104I和KpnI酶切位点将Monellin基因克隆到载体pPICZaA,得到重组质粒pPICZA-Mon,质粒经SacI酶切线性化后,电击转入毕赤酵母宿主菌GSll5,得到工程菌GS115-pPICZA-Mon。通过PCR验证得到阳性转化子,通过甲醇诱导后,发酵产物经TrincneSDS-PAGE检测表明甜蛋白Monellin在毕赤酵母中胞内表达成功。2采用DesignExpert7.0软件,利用响应面法对毕赤酵母发酵盐培养基进行优化。首先用P1ackett-Burman方法研究发酵培养基各成分对响应值的影响,结果表明酵母提取物、硫酸钙和磷酸缓冲液为三个主要因素;利用最陡爬坡法逼近最大响应区域;最后通过中心组合设计和响应面分析得到最优培养基组成为:6g/L酵母提取物,0.3g/L硫酸钙,4.5g/L硫酸镁,40g/L甘油,12.5g/L硫酸铵,7.7%100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)。在优化培养基条件下培养,工程菌生物量增加0.5倍。3以摇瓶优化得到的发酵盐培养基为基础,在德国Bamn公司5L发酵罐上进行补料-分批发酵。甘油耗尽后开始补加甘油,当菌体浓度OD600达到200左右时开始补加甲醇甘油混合物,4-5h后开始补加甲醇进行诱导,整个过程维持DO大于20%,发酵72h后,最终菌体光密度OD600达到521,甜蛋白Monellin表达量达1.2g/L。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第1章 文献综述  11-27
  1.1 甜蛋白简介  11-18
    1.1.1 甜味剂的应用  11-12
    1.1.2 甜蛋白的种类和基本性质  12-14
    1.1.3 甜蛋白的研究进展  14-18
  1.2 毕赤酵母表达系统  18-24
    1.2.1 表达系统简介  18-20
    1.2.2 毕赤酵母表达系统的优点  20-21
    1.2.3 毕赤酵母表达宿主菌  21-22
    1.2.4 毕赤酵母的表达载体  22-23
    1.2.5 影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素  23-24
  1.3 响应面法优化基础盐培养基  24-25
  1.4 本研究的目的和意义  25-27
第2章 毕赤酵母胞内表达甜蛋白 Monellin 工程菌的构建  27-40
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 菌株和质粒  27
    2.1.2 酶和试剂  27
    2.1.3 主要实验仪器  27
    2.1.4 主要试剂的配制  27-28
  2.2 实验方法  28-36
    2.2.1 目的基因的获取  28-30
    2.2.2 质粒载体pPICZαA 的制备  30-31
    2.2.3 目的基因与质粒pPICZαA 的双酶切及酶切产物切胶回收  31-33
    2.2.4 酶切产物的连接及转化感受态细胞  33
    2.2.5 重组表达质粒载体pPICZA-Mon 的鉴定  33-34
    2.2.6 重组表达质粒导入毕赤酵母及阳性转化子的筛选  34-36
  2.3 结果与讨论  36-39
    2.3.1 Monellin 基因的设计与合成  36
    2.3.2 质粒表达载体pPICZA-Mon 的构建  36-38
    2.3.3 重组质粒pPICZA-Mon 的验证  38
    2.3.4 毕赤酵母阳性重组子的 PCR 鉴定  38-39
  2.4 小结  39-40
第3章 甜蛋白 Monellin 在毕赤酵母中的表达及响应面法优化发酵盐培养基  40-58
  3.1 实验材料  40-42
    3.1.1 菌株  40
    3.1.2 实验仪器  40
    3.1.3 常用试剂  40-42
  3.2 实验方法  42-46
    3.2.1 菌种的活化  42
    3.2.2 重组子的诱导表达  42-43
    3.2.3 Tricine SDS-PAGE 检测表达蛋白  43-44
    3.2.4 响应面优化发酵盐培养基  44-46
    3.2.5 重组毕赤酵母工程菌在发酵罐中高密度发酵  46
  3.3 结果与讨论  46-56
    3.3.1 Tricine SDS-PAGE 检测蛋白表达  46-47
    3.3.2 响应面优化培养基  47-56
    3.3.3 培养基优化前后蛋白表达量比较  56
  3.4 小结  56-58
第4章 结论与展望  58-60
  4.1 本研究的主要结论  58
  4.2 本研究的创新之处  58-59
  4.3 展望  59-60
参考文献  60-68
致谢  68-69
缩写符号说明  69-70
攻读学位期间的研究成果  70

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酵母制造
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