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草鱼PKR基因的克隆、表达特性及功能分析

作　者: 李雯
导　师: 胡成钰
学　校: 南昌大学
专　业: 微生物学
关键词: 草鱼 PKR dsRBMs eIF2α 翻译抑制细胞凋亡
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

先天性免疫(innate immunity)是生物体快速识别和抵抗入侵病原微生物的第一道防线,在控制病原体在体内扩散和清除体内病原体方面起着重要作用。干扰素是机体先天性免疫抵抗病毒侵染的重要组成成分,它通过激活干扰素刺激基因(Interferon stimulation genes ISGs)诱导多种抗病毒蛋白的表达来实现抗病毒作用,目前研究较多的抗病毒蛋白主要包括双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)、2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶(2’,5’OAS)、核糖核酸酶L(RNase L)、RNA特异性腺苷酸脱氨酶(ADAR)和抗粘液病毒蛋白(Mx)。其中PKR是IFN抗病毒作用过程中最重要的效应蛋白之一本文通过同源克隆和RACE技术得到了草鱼PKR(CiPKR,JX511974)基因,其全长cDNA为2436bp,包括5’非翻译区(5’UTR)170bp,3’非翻译区(3’UTR)199bp,最大开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)2067bp,其中ORF编码一个688aa的蛋白质。预测的蛋白分析显示,CiPKR的N-端包含3个串联的双链RNA结合序列(dsRBMs),C-端为保守的丝氨酸/苏氨酸激酶区。系统树显示CiPKR与鲫鱼PKR(CaPKR)和斑马鱼PKR(DrPKR)具有高度的同源性。CiPKR在草鱼各组织和草鱼肾细胞(CIK)中都有低水平的组成型表达,但是Poly I:C处理后就有明显的上调表达。为了进一步了解CiPKR的功能,单独克隆了其3个dsRBMs,连接至表达载体pET-32a,亲和层析获得各个纯化的融合多肽(PdsRBMs),然后通过12%非变性PAGE电泳研究其二聚化的能力,结果显示3个dsRBMs都能形成二聚体,但是聚合程度不同。同时,将pcDNA3.1/PKR系列重组质粒和PGL-3-promoter质粒共转染至草鱼肾细胞(CIK)发现CiPKR能明显的抑制萤光素酶蛋白的表达；另一方面,将pcDNA3.1/PKR系列重组质粒单转至CIK后,用MTT的方法检测细胞活性,发现转染CiPKR的情况下细胞活性明显降低。这些结果说明CiPKR的过表达能够抑制蛋白质的翻译进而诱导细胞凋亡。

草鱼PKR基因的克隆、表达特性及功能分析

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