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胰岛素抵抗大鼠肝脏组织PERK和p-PERK的表达及意义

作　者: 林志楠
导　师: 都健
学　校: 中国医科大学
专　业: 内科学
关键词: 胰岛素抵抗内质网应激大鼠肝脏组织磷酸化PKR样内质网调节激酶
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

前言糖尿病(DM)是严重危害人类健康的常见病,目前全世界有1亿7千万DM患者,预计在未来25年内DM患者将达到3亿6千万。临床上DM主要分为1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM),而T2DM占DM的90%-95%。T2DM是以骨骼肌、肝脏及脂肪等胰岛素靶组织胰岛素抵抗为主要特征。T2DM的发病机制目前尚不完全清楚,近年研究发现,内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERstress)在肥胖所致胰岛素抵抗中占重要地位,与靶组织胰岛素抵抗和胰岛B细胞功能障碍密切相关；因此ER应激在肥胖导致的胰岛素抵抗中的作用已成为当前糖尿病研究的热点领域。内质网(endoplasmic reticulum, ER)是细胞内重要的细胞器,是调节蛋白质合成及合成后折叠及聚集的场所,是调节细胞的应激反应及细胞钙水平的场所,也是胆固醇和类固醇及许多脂质合成的场所。在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应以及钙离子稳态失衡等各种因素作用下,新生肽链的修饰折叠与组装受到干扰,将引起未折叠蛋白在ER中堆积,使细胞产生内质网应激(ERS),并激活未折叠蛋白反应(UPR)信号转导通路,导致细胞自身通过改变其转录和翻译过程,减少蛋白的合成,降低进入内质网的蛋白量,同时上调内质网中分子伴侣和折叠蛋白的表达,增强内质网的蛋白折叠功能。细胞还可以通过上调内质网蛋白降解途径的相关基因表达,加速未折叠蛋白的降解过程,以提高细胞在有害因素下的生存能力。ERS是在应激条件下,为维持细胞内环境稳定,保持细胞生存,细胞启动的自我保护反应机制。研究发现,经过16周高脂饮食的小鼠和正常饮食小鼠相比,脂肪组织中ERs的标志,如PREK磷酸化和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)活性均明显增加,ob/ob小鼠和野生型小鼠相比,脂肪组织中磷酸化的PERK和IRE-la明显增高,并且JNK活性和XBP-1的剪接也明显增加,这些均提示肥胖可以导致脂肪细胞ERs。但肥胖的脂肪组织中发生ERs的原因目前仍不清楚。但有以下几种假说：①在营养过剩的情况下,内质网中蛋白质合成明显增加,诱发UPR；②过剩的营养物质可以作为诱导ERs的信号,在肥胖状态下,血浆游离脂肪酸(FFA)水平明显升高,研究发现,在肝细胞和胰岛B细胞中,FFA可以诱导UPR,但是在脂肪细胞中,FFA对内质网功能的影响目前还不清楚,在3T3-L1脂肪细胞中,FFA可以激活JNK,导致IR。而UPR同样可以激活JNK,所以FFA可能和ERs存在联系；③肥胖时发生ERs的一个原因是葡萄糖缺乏状态,这在许多细胞,包括脂肪细胞中都被认为是ERs的诱因。在肥胖的脂肪细胞中,因为细胞内IR,胰岛素信号通路受到抑制,糖份摄取减少,细胞在葡萄糖缺乏或不稳定的情况下,容易发生应激。Hosogai等。发现,肥胖小鼠的脂肪组织和野生型小鼠相比,会出现明显的低氧征象,在培养的脂肪细胞中,低氧会诱导UPR,表现为Bip等表达增加,eIF2a磷酸化和XBP-1剪接增加。以上多种因素共同作用,相互调节,导致肥胖的脂肪细胞发生ERs。为了应对和适应ERS.细胞需要一条由ER到核内的信号转导途径来提高ER蛋白折叠能力,这条途径就是非折叠蛋白反应(UPR)。UPR主要包括3条信号通路。分别由3种类型的ER驻留蛋白起始：1型ER转膜蛋白激酶(type-lER transmembrane protein kiIlase IRE1)、双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶(PKR like ER kinase PERK)和活化转录因6(activating transcription factor 6 ATF6)。另外。近来报道也从不同的细胞中分离得到了其他类型的信号感受器和通路。UPR不仅增加了ER膜的数量还增加了与蛋白折叠相关的分子伴侣和蛋白修饰酶的数量。同时还通过阻止蛋白翻译减少了去往ER的蛋白量。最后.未折叠多肽返回胞质并通过蛋白酶体依赖的途径降解.这个过程称为ER相关降解(ER-Associated degradation ERAD)。但是,如果最终ER的正常功能没有恢复.例如长时间剧烈的UPR可能导致细胞走向凋亡。因此,一旦没有正确折叠而失去功能的蛋白出现在细胞表面.这个细胞就可能很快被组织清除.近年来的研究发现,ERS与胰岛B细胞的生存、凋亡及糖尿病的发生密切相关,而对糖尿病过高ERS状态进行适当干预,则可能成为糖尿病治疗的新手段。目前,虽然ERS参与糖尿病的研究己渐成热点,但有关ERS介导胰岛B细胞功能受损及胰岛素抵抗的确切机制,ERS在不同类型糖尿病起病以及糖尿病并发症中所扮演的角色,内质网分子伴侣在糖尿病治疗中的应用,ERS与糖尿病并发症共同通路氧化应激间的关系等,还需进一步阐明。材料与方法SPF级4周龄雄性Wistar大鼠30只,体质量80-120g,购自中国医科大学实验动物中心。大鼠适应性喂养1周后,随机分为正常饮食组(NC组,n=15)和高脂饮食组(HF组,n=15)。NC组给予基础饲料喂养,作为对照组。HF组给予高脂饲料喂养,建立胰岛素抵抗大鼠模型。10周后,每组随机抽取5只行高血浆胰岛素-正常血糖钳夹以评估胰岛素抵抗大鼠模型建立。左颈总动脉接肝素生理盐水注射器,右股静脉接三通管后分别接装有40mU/mL的人胰岛素注射液(丹麦诺和诺德公司产品)和10%葡萄糖注射液的50 mL注射器,再接微量输液泵。静置30 min后,颈总动脉取血1 mL测基础血糖和基础胰岛素。首先输注胰岛素,输注率1.67 mU·kg-1·min-1),每5min颈动脉取血1滴测血糖,当血糖>(基础值±0.5)mmol/L时开始输注葡萄糖,输注率从4-6 mg·kg-1·min-1开始。每5min测血糖一次,调整葡萄糖输注率,使血糖保持在(基础值±0.5)mmol/L,连续3次血糖都在上述范围内,钳夹形成。实验共计约2 h,计算60～120 min的平均GIR,评价胰岛素的敏感性。颈动脉血样4℃,3000×g,离心15 min,分离血清置-80℃冰箱冻存。NC组和HF组未做钳夹的20只大鼠禁食16 h,经10%水合氯醛(0.3mg/kg)腹腔内麻醉后,腹主动脉穿刺取血约4 mL,4℃,3000×g,离心15 min后,分离血清置-80℃冰箱冻存。肝脏组织剪成约100 mg大小的组织块,剔除血管和其他结缔组织,清洗后蘸干,放入1.5 ml EP管中于-80℃冰箱中冻存。取肝脏组织100 mg,加入1 ml蛋白裂解液,超声匀浆静置30 min后,4℃,12000×g,离心30 min,取上清,BCA法蛋白定量。取含总蛋白30μg的样品进行SDS-PAGE电泳,湿转法将蛋白条带转移到PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h后依次加入一抗(兔抗大鼠PERK单克隆抗体,1：500稀释)、二抗(辣根过氧化酶标记的山羊抗兔单克隆抗体,1：5000稀释),洗膜后用增强化学发光法显像,用凝胶图像分析系统分析结果。检测p-PERK蛋白水平时一抗为兔抗大鼠p-PERK单克隆抗体(1：1000稀释),二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体(1：5000稀释)。取100μL冻存的血清,应用大鼠胰岛素ELISA试剂盒(R&D公司),依据说明书进行操作,检测基础状态下的血清胰岛素水平。结果与NC组相比,HF组60-120 min的平均葡萄糖输注率(GIR60-120)明显低于NC组(0.90±0.15mg·kg"1·min-1 vs 4.97±0.68 mg·kg-1·min-1, P<0.01).与NC组相比,HF组大鼠肝脏p-PERK表达明显升高(192.89±25.16 vs 63.04±15.61,P<0.05),p-PERK/PERK也明显升高(0.99±0.12 vs 0.33±0.08,P<0.05)讨论本研究结果显示HF组大鼠基础胰岛素水平高于NC组(P<0.05)并且HF组大鼠GIR60-120显著低于NC组(P<0.01),证实IR大鼠模型成功建立；肝脏组织PERK和p-PERK蛋白的表达上,HF组大鼠肝脏组织PERK的表达水平与NC组相比无明显差异(P>0.05),而p-PERK表达显著升高(P<0.05)。并且HF组大鼠肝脏组织p-PERK/PERK的比值也显著升高(P<0.05)。证实在高脂饮食诱导的IR大鼠模型中存在ERS。在本研究中PERK的表达两组没有显著差异可能是因为PERK在生理状态下也表达。ERS时一部分PERK通过磷酸化而活化,从而激活其下游的通路。本研究高脂饲料配方中新鲜猪油的主要成分是饱和脂肪酸,10周高脂饲料喂养后,与NC组相比,HF组大鼠体重和基础血糖无明显差异(P>0.05),而血清TG水平显著升高(P<0.01),HF组大鼠肝脏组织p-PERK蛋白的表达水平也明显升高(P<0.05),并且基础胰岛素水平也显著升高(P<0.05)。这些结果表明高脂喂养可能通过脂毒性造成肝脏组织ERS,从而引起IR。营养信号和ERS可以激活PERK,活化的PERK通过激活重要的炎症激酶c-Jun氨基端激酶(JNK)而调节胰岛素的活性。PERK也可以直接作用于胰岛素受体底物(IRS)而改变胰岛素的活性。结论胰岛素抵抗大鼠肝脏组织中p-PERK蛋白及p-PERK/PERK升高,提示内质网应激(ESR)可能参与胰岛素抵抗的发生

全文目录

一、摘要  4-14
  中文论著摘要  4-9
  英文论著摘要  9-14
二、英文缩略语  14-15
三、论文  15-26
  前言  15-17
  实验材料与方法  17-18
  实验结果  18-21
  讨论  21-22
  结论  22-23
  本研究创新性的自我评价  23-24
  参考文献  24-26
四、附录  26-38
  综述  26-36
    参考文献  33-36
  在学期间科研成绩  36-37
  致谢  37-38
  个人简介  38

胰岛素抵抗大鼠肝脏组织PERK和p-PERK的表达及意义

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