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微藻整合表达载体构建及ACCase的生物信息学分析

作　者: 付静娟
导　师: 宋东辉
学　校: 天津科技大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 生物柴油蓝藻乙酰辅酶A羧化酶克隆整合载体构建生物信息学
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

生物柴油作为石化燃料的替代能源,已在国际上得到了广泛的应用。利用基因工程技术获得高油脂微藻,是当今国际上开发生物柴油的有前景的方向之一。蓝藻作为一种简单的原核光合生物,生长迅速,油脂含量较高；同时适应性强,便于遗传操作,通过基因工程改造适合作为生物柴油的原料。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是脂肪酸代谢中的关键酶,在生物体内催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A的反应,这是脂肪酸从头合成的第一步也是限速步骤。本研究主要包括整合表达载体的构建和微藻ACCase的生物信息学分析两部分。(一)成功构建了蓝藻pAnFP整合表达载体,并克隆了鱼腥藻7120(Anabaena sp. PCC7120)编码乙酰辅酶A羧化酶CT-β亚基的accD基因。构建的蓝藻pAnFP整合表达载体包括整合片段F(有两个侧翼的整合片段F1和F2),启动子PpsbA1,以及带有自己启动子的新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ。利用PCR扩增技术,从鱼腥藻7120基因组DNA获得两个整合片段Fl和F2以及启动子PpsbA1,新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ来自原核表达载体pET30。accD基因克隆到载体pBS-T上,经DNA序列测定确定此基因即为鱼腥藻7120ACCase CT-β功能域基因。(二)采用生物信息学的方法对不同蓝藻ACCase的各亚基的理化性质、信号肽、跨膜区、疏水性／亲水性、蛋白质二、三级结构等进行了生物信息分析与预测,并构建不同物种ACCase各亚基的系统进化树。蓝藻ACCase的BC亚基和BCCP亚基是不稳定蛋白,并且没有明显的卷曲结构；CT-α亚基和CT-β亚基为稳定蛋白,具有明显的卷曲结构；四个亚基均无信号肽和跨膜结构区,BC亚基的保守结构域最多有7个；二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,零星散布着少量的延伸链。在ACCase进化关系上,不同亚基的系统进化关系有一定差异性,但总的来说类似于相近物种的亲缘关系也相近,原核蓝藻ACCase之间进化距离最近,表明其进化途径非常稳定,是由同一个祖先共同进化而来的；其次是原核蓝藻与真核藻和油料植物关系较近,表明它们来自于一个进化关系较近的祖先物种；微藻与高等动物、酵母菌的进化距离最远,表明其亲缘关系较远,很早就与其他物种分开进化。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-29
  1.1 蓝藻基因工程  9-15
    1.1.1 蓝藻  9-11
    1.1.2 蓝藻基因组概述  11-12
    1.1.3 蓝藻基因工程载体  12-13
    1.1.4 同源重组法在蓝藻中表达外源基因  13-14
    1.1.5 蓝藻外源基因的转化方法  14-15
  1.2 乙酰辅酶A羧化酶简介  15-24
    1.2.1 ACCase的分布及类型  15-17
    1.2.2 ACCase的基因  17-19
    1.2.3 ACCase的结构  19-23
    1.2.4 ACCase的生物学功能  23-24
    1.2.5 ACCase在微藻中的研究  24
  1.3 生物信息学的相关研究  24-27
    1.3.1 生物信息学的产生和发展  24-25
    1.3.2 生物信息学的研究内容  25-26
    1.3.3 生物信息学在微藻中的应用  26-27
  1.4 利用微藻制备生物柴油的研究进展  27-28
    1.4.1 微藻生物柴油的优势  27-28
    1.4.2 微藻生物柴油的研究进展  28
  1.5 本研究的目的和内容  28-29
2 材料与方法  29-38
  2.1 实验材料  29-31
    2.1.1 主要仪器  29
    2.1.2 主要试剂  29
    2.1.3 蓝藻藻种、菌种和质粒  29-30
    2.1.4 培养基及溶液配制  30
    2.1.5 蓝藻的培养、纯化、保种及扩大培养  30-31
  2.2 实验方法  31-38
    2.2.1 获得目的基因片段  31-33
    2.2.2 目的基因的克隆  33-35
    2.2.3 整合表达载体的构建  35
    2.2.4 ACCase的生物信息学分析  35-38
3 结果与讨论  38-75
  3.1 鱼腥藻7120的培养  38-39
  3.2 pAnFP整合载体的构建  39-52
    3.2.1 基因组DNA的提取  39-40
    3.2.2 P_(psbAl),F1,F2,nptⅡ片断的PCR的扩增  40-41
    3.2.3 重组质粒鉴定  41-43
    3.2.4 序列测定与分析  43-47
    3.2.5 pP_(psbal)-F2载体构建与鉴定  47-48
    3.2.6 pF1-P_(bsbal)-F2载体构建与鉴定  48-49
    3.2.7 pAnFP载体构建与鉴定  49
    3.2.8 accD基因的克隆与鉴定  49-52
  3.3 ACCase的生物信息学分析  52-72
    3.3.1 不同蓝藻ACCase的氨基酸序列分析  52-56
    3.3.2 不同蓝藻二级结构的预测和分析  56-58
    3.3.3 不同蓝藻ACCase氨基酸序列的保守结构域分析  58-59
    3.3.4 鱼腥藻7120信号肽和跨膜结构域的预测和分析  59-60
    3.3.5 鱼腥藻7120亲水/疏水性预测和分析  60-63
    3.3.6 鱼腥藻7120 ACCase各亚基卷曲结构的预测  63-65
    3.3.7 鱼腥藻7120 ACCase各亚基结构域的预测  65-66
    3.3.8 鱼腥藻7120 ACCase各亚基三级结构预测  66-68
    3.3.9 分子进化树的构建与分析  68-72
  3.4 讨论  72-75
    3.4.1 载体构建  72
    3.4.2 生物信息学  72-75
4 结论  75-77
5 展望  77-78
6 参考文献  78-84
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  84-85
8 致谢  85

微藻整合表达载体构建及ACCase的生物信息学分析

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